Prosedur Analisis - METODOLOGI PENELITIAN

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.6 Prosedur Analisis

3.6.1 Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimal

Panjang gelombang analisis ditentukan dengan cara membuat spektrum serapan dari Natrium benzoat dan Kalium sorbat menggunakan spektrofotometer UV. Kemudian spektrum serapan yang diperoleh dibuat overlapping untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa keduanya memberikan serapan maksimum. Pada pengukuran panjang gelombang ini, Natrium benzoat dan Kalium sorbat masing – masing dibuat dengan konsentrasi 4,7 ppm dan 1,85 ppm. Kondisi lainnya yang divariasikan untuk mendapatkan hasil analisis optimum adalah komposisi fase gerak dan laju alir. Perbandingan fase gerak metanol-dapar

fosfat yang divariasikan 5:95, 10:90, dan 30:70, sedangkan laju alir divariasikan 0,8 dan 1 ml/menit. Kondisi kromatografi yang memberikan waktu tambat singkat, jumlah lempeng teoritis yang tinggi dan tailing faktor paling kecil selanjutnya dipilih sebagai kondisi yang akan digunakan dalam penelitian ini. 3.6.2 Analisis Kualitatif

Natrium benzoat BPFI dengan konsentrasi 60 ppm dan baku Kalium sorbat dengan konsentrasi 20 ppm disuntikkan ke sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µm pada kondisi yang terpilih. Waktu tambat Natrium benzoat dan Kalium sorbat dibandingkan dengan waktu tambat dari masing-masing sirup. 3.6.3 Pengukuran Sampel

Ditimbang 5 gram sirup, kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 50ml, lalu dilarutkan dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda. Dikocok-kocok ± 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ m kemudian diawaudarakan selama 15 menit. Masing-masing sampel diinjeksikan sebanyak 6 kali ke sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl diukur pada panjang gelombang 230 nm dengan laju aliran 0,8 ml/menit.

3.6.4 Pembuatan Larutan Induk Baku (LIB)

3.6.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku natrium benzoat

Ditimbang seksama 50 mg Natrium benzoat BPFI, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml. Kemudian ditambahkan dengan sedikit pelarut, kocok hingga larut. Setelah larut, diencerkan lagi dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm (LIB I).

Dari LIB I dipipet 10 ml, lalu dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, kemudian diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 ppm (LIB II).

3.6.4.2 Pembuatan Larutan Induk Baku kalium sorbat

Ditimbang seksama 50 mg Baku kalium sorbat, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml. Kemudian ditambahkan dengan sedikit pelarut, kocok hingga larut. Setelah larut, diencerkan lagi dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm (LIB I).

Dari LIB I dipipet 10 ml, lalu dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, kemudian diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 ppm (LIB II).

3.6.5 Pembuatan Kurva Kalibrasi Natrium benzoat dan Kalium sorbat

Untuk Kurva kalibrasi, Natrium benzoat dibuat dengan konsentrasi 5, 20, 40, 60 dan 80 ppm, sedangkan Kalium sorbat 1, 10, 20, 40 dan 60 ppm.

Tahap-tahap pembuatan larutan campuran Natrium benzoat dan Kalium sorbat dengan konsentrasi di atas adalah sebagai berikut :

- Benzoat 5 ppm & Sorbat 1 ppm, dibuat dengan memipet 0,5 ml dari LIB II Natrium benzoat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10 ppm (larutan A).

Kemudian Dipipet 0,5 ml dari LIB II Kalium sorbat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10 ppm (larutan B).

Dari larutan A dipipet 5 ml dan dari larutan B dipipet 1 ml lalu dimasukkan ke labu 10 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas.

- Benzoat 20 ppm & Sorbat 10 ppm, dibuat dengan memipet 5 ml dari LIB II Natrium benzoat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 ppm (larutan A).

Kemudian Dipipet 5 ml dari LIB II Kalium sorbat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 ppm (larutan B).

Dari larutan A dipipet 5 ml dan dari larutan B dipipet 2,5 ml lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas.

- Benzoat 40 ppm & Sorbat 20 ppm, dibuat dengan memipet 5 ml dari LIB II Natrium benzoat dan 2,5 ml dari LIB II Kalium sorbat, lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas.

- Benzoat 60 ppm & Sorbat 40 ppm, dibuat dengan memipet 7,5 ml dari LIB II Natrium benzoat dan 5 ml dari LIB II Kalium sorbat, lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas.

- Benzoat 80 ppm & Sorbat 60 ppm, dibuat dengan memipet 10 ml dari LIB II Natrium benzoat dan 7,5 ml dari LIB II Kalium sorbat, lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas.

3.7 Penetapan kadar sampel

Kadar Natrium benzoat dan Kalium sorbat (X) dihitung dengan mensubstitusi luas puncak ke dalam persamaan regresi yang diperoleh dari kurva

kalibrasi pada bagian 2.5.4.1 sebagai (Y). Hasilnya lalu dikali dengan volume pengenceran (50 ml ), kemudian dibagi dengan berat penimbangan sampel sehingga diperoleh kadar Natrium benzoat dan Kalium sorbat dalam sirup dengan satuan mcg/g (ppm) sampel.

Rumus perhitungan kadar Natrium benzoat dan Kalium Sorbat dalam sirup dituliskan sebagai berikut :

Kadar Natrium benzoat dan Kalium sorbat dalam sirup (mcg/g sampel) : = X (mcg/ml) x ) ( ) ( g berat ml n pengencera 3.8 Validasi Metode 3.8.1 Akurasi

Uji akurasi dengan parameter % recovery dilakukan secara metode penambahan baku (standard addition method) kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Metode adisi ini dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang akan diperiksa. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa persen analit yang ditambahkan tadi dapat ditemukan.

% Perolehan kembali = A A F C C C * − _{x 100%}

Keterangan : CF = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan

larutan baku

CA = konsentrasi sampel sebelum penambahan larutan baku

C*A = konsentrasi larutan baku yang ditambahkan

3.8.2 Presisi

Uji presisi ditentukan dengan parameter RSD dengan rumus : RSD =

X SD

Keterangan : RSD = Relative Standar Deviasi SD = Standar Deviasi

X = Kadar rata-rata Na Benzoat dan K Sorbat dalam sampel

3.8.3 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Batas deteksi (Limit Of Detection/LOD) dan batas kuantitasi (Limit Of Quantitation/LOQ) dihitung dari persamaan regresi kurva kalibrasi baku pembanding. Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut.

2 ) ( 2 − − =

∑

n Yi Y SB Slope SB x LOD=3 Slope SB x LOQ=10

Keterangan : SB = Simpangan Baku 3.9 Analisa data secara statistik

Untuk menghitung Standar Deviasi (SD) digunakan rumus :

SD =

( )

1 2 − −

∑

n x x

Keterangan : SD = Standar deviasi x = kadar sampel

x = kadar rata-rata sampel n = jumlah perlakuan.

Kadar dapat dihitung dengan persamaan regresi dan untuk menentukan data dapat diterima atau ditolak digunakan rumus :

t hitung = n SD X X / −

Data diterima jika t hitung < t tabel.

Untuk menghitung kadar sebenarnya dengan α = 0,01; dk = n-1, digunakan rumus: μ = X n SD x t(1−1/2α).dk ±

X = kadar rata-rata Natrium benzoat dan Kalium sorbat dalam sampel

Dalam dokumen Optimasi Fase Gerak Metanol-Dapar Fosfat dan Laju Alir pada Penetapan Kadar Natrium Benzoat dan Kalium Sorbat dalam Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Halaman 41-48)