METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
3.5 Prosedur Kerja .1 Sterilisasi .1 Sterilisasi
3.3 Variabel Penelitian
Variabel yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari 3 variabel yang meliputi: 1) variabel bebas, 2) variabel terikat, 3) variabel kontrol. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah jenis dan konsentrasi antibiotik. Variabel terikat yaitu variabel yang dapat diukur, yaitu: jumlah eksplan bertunas (buah), persentase
browning (%), dan persentase kontaminasi (%). Variabel kontrol pada penelitian
ini yaitu suhu, hormon, cahaya, medium MS dan pH.
3.4 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam persiapan media yaitu meliputi: timbangan analitik, gelas ukur, pipet, labu erlenmeyer, pengaduk, botol kultur, hotplate, dan
autoclave. Sedangkan untuk kegiatan penanaman alat-alat yang digunakan antara
lain Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), handsprayer, lampu bunsen, pinset, pisau, scalpel, tissue, dan cawan petri.
Bahan-bahan yang diperlukan dalam pembuatan media antara lain agar-agar, gula pasir, air steril, bubuk media MS, BAP, propolis, dan PPM. Sedangkan untuk kegiatan sterilisasi dan penanaman bahan-bahan yang digunakan yaitu deterjen, fungisida, bakterisida, clorox 10%, air steril, alkohol 70%, alkohol 96% dan eksplan sirsak bagian titik tumbuh. Bahan eksplan sirsak berasal dari UPT Materia Medica Batu Jawa Timur.
3.5 Prosedur Kerja 3.5.1 Sterilisasi
3.5.1.1 Sterilisasi Alat dan Media Kultur
Alat-alat yang akan digunakan dalam kegiatan kultur jaringan seperti botol kultur, pinset, scalpel, cawan petri, pipet, pengaduk, labu takar dicuci bersih
38
menggunakan detergen. Kemudian, alat-alat yang digunakan dalam penanaman disterilisasi dengan membungkus cawan petri menggunakan kertas tebal dan alat-alat seperti spatula, pinset, scalpel menggunakan alumunium foil dan dibungkus plastik. Kemudian semua alat-alat tersebut diautoklaf pada suhu 121⁰C-126⁰C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Sedangkan untuk media yang telah dimasukan ke dalam botol kultur lalu dimasukan ke dalam autoclave pada suhu 121⁰C -126⁰C dan tekanan 1 atm selama 60 menit.
3.5.1.2 Sterilisasi Lingkungan Kerja
Sterilisasi lingkungan kerja dilakukan dengan membersihkan laboratorium secara berkala dengan mengepel dan menyemprot rak kultur. Dilakukan pula penyeleksian botol kultur yang terkontaminasi. Pembersihan tempat kerja LAFC dilakukan dengan mengelap permukaan atau meja LAFC menggunakan kapas atau tisu yang telah disemprot alkohol 70%. Kemudian dinyalakan sinar UV selama 1 jam, sebelum dan selama pemakaian, blower atau peniup udara dalam
laminar air flow cabinet dinyalakan untuk menghindari adanya kontaminan yang
masuk ke dalam botol kultur selama proses penanaman. Kemudian sebelum melakukan pekerjaan dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70% terhadap kedua telapak tangan, botol kultur, ataupun alat-alat yang akan digunakan dalam penanaman.
3.5.1.3 Sterilisasi Bahan Eksplan
Sirsak yang diambil sebagai eksplan diberi perlakuan sterilisasi yang meliputi sterilisasi eksplan di luar LAFC dan sterilisasi eksplan di dalam LAFC. Adapun tahapan sterilisasi di luar LAFC yaitu eksplan dari bahan indukan dicuci dengan air bersih direndam kedalam larutan deterjen dan dibilas dengan air bersih selama
39
1 jam. Eksplan yang telah bersih direndam dalam fungisida 300 mg/L selama 10 menit. Selanjutnya direndam dalam bakterisida 300 mg/L selama 5 menit dan dibilas dengan air mengalir selama 1 jam. Sedangkan tahapan sterilisasi eksplan di dalam LAFC menggunakan air steril selama ± 5 menit, clorox bertahap 20%, 10%, dan 5% selama ± 3 menit, selanjutnya dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit.
3.5.2 Pembuatan Media
3.5.2.1 Pembuatan media Murashige Skoog (MS) dengan Larutan BAP
Pembuatan media dilakukan dengan pembuatan media 1 MS yaitu larutan media dengan volume akhir 1 liter. Pelaksanaan pembuatan media dimulai dengan menyiapkan 1 liter akuades dalam beaker glass. Selanjutnya ditimbang gula sebanyak 30 gr, bubuk MS sebanyak 4,43 gr, dan agar-agar sebanyak 10 gr. Dalam penelitian ini terdapat 25 perlakuan yang berbeda sehingga penimbangan agar-agar 10 gr dibagi 25 menjadi 0,40 gr per perlakuan.
Selanjutnya dimasukkan bahan-bahan seperti gula, 1,5 ml hormon (BAP) dan bubuk MS ke dalam beaker glass yang berisi 1 liter akuades kemudian diaduk menggunakan magnetic stirrer. Dilakukan pengukuran pH yaitu antara 5,7-6,0 dengan penambahan HCl dan NaOH.
3.5.2.2 Pembuatan media perlakuan
Pembuatan media perlakuan dimulai dengan proses yang sama ketika membuat media kontrol (MS 0 + BAP 1,5). Tetapi untuk membuat media perlakuan pada larutan (MS 0 + BAP 1,5) ditambahkan antibiotika berupa PPM dan/atau propolis dengan konsentrasi yang sesuai dengan perlakuan yang sudah ditentukan yakni sebesar 0 ml/L, 0,5 ml/L, ml/L, dan 1,5 ml/L. sebelum
40
ditambahkan antibiotika, larutan media kontrol 1 liter tersebut dibagi ke dalam 25 botol. Kemudian dapat ditambahkan antibiotik sesuai perlakuan. Setelah larutan media perlakuan selesai dibuat, kemudian dilakukan pengukuran dengan menggunakan pH meter. Pada umumnya pH media yang digunakan yakni 5,7-6,0, jika larutan tersebut dihasilkan pH >6,0 maka dilakukan penambahan HCl dan jika dihasilkan pH <5,6 maka dilakukan penambahan NaOH.
Selanjutnya larutan media ditambahkan dengan agar-agar sebanyak 0,4 gr per perlakuan dan dimasak hingga mendidih. Kemudian larutan dituangkan kedalam botol-botol kultur sebanyak 10 ml. Ditutup botol-botol tersebut dengan rapat setelah mulai dingin dan diberi label. Langkah selanjutnya yaitu melakukan sterilisasi media tersebut dalam autoclave pada suhu 121⁰C dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit.
3.5.3 Penanaman Eksplan
Penanaman eksplan sirsak dilakukan di dalam LAFC yang sudah disterilisasi sebelumnya. Setelah dilakukan sterilisasi pada eksplan, kemudian eksplan dimasukkan ke dalam cawan petri untuk dipotong dengan ukuran 1,5 cm dalam satu nodus. Kemudian ditanam ke dalam media kultur dengan posisi tegak. Botol-botol yang sudah ditanami diberi label kemudian diletakkan di dalam rak kultur di ruang inkubasi.
3.5.4 Pemeliharaan Kultur
Botol-botol yang berisi eksplan diletakkan ke dalam rak kultur dan disemprot dengan alkohol 70% setiap 3 hari sekali. Kondisi lingkungan pemeliharaan menggunakan suhu 20-250C dan menggunakan pencahayaan 2000 LUX.
41 3.5.5 Pengamatan
Pengamatan kontaminasi dilakukan ±2 minggu setelah tanam dan pertumbuhan tunas dilakukan ±4 minggu setelah tanam dan pengambilan data dilakukan setiap hari. Parameter yang diamati yaitu:
1. Jumlah eksplan yang hidup dilihat dari hari keberapa tunas terbentuk pada eksplan, dihitung dari hari setelah tanam (HST) yang ditandai dengan jumlah eksplan yang berwarna kehijauan dan munculnya tunas pada nodus batang. 2. Jumlah eksplan yang mati dilihat dari hari keberapa eksplan mulai tidak
tumbuh, dihitung dari hari setelah tanam (HST) yang ditandai dengan jumlah eksplan yang mengalami browning (pencoklatan) atau berwarna merah dan tidak muncul tunas.
3. Jumlah eksplan yang mengalami kontaminasi dilihat dari hari keberapa eksplan mulai terlihat adanya titik kontaminasi, dihitung dari hari setelah tanam (HST) yang ditandai dengan adanya jamur (muncul hifa seperti benang yang berwarna putih sampai abu-abu) dan bakteri (adanya lendir).
Pengaruh pemberian antibiotik pada pertumbuhan eksplan sirsak diketahui dengan melakukan pengamatan terhadap warna eksplan, kondisi tunas eksplan, dan jumlah daun yang tumbuh.