Ekstraksi steroid dilakukan berdasarkan metode yang dilaporkan oleh Touchstone dan Kasparow (1970) yang dikutip Riris (1994). Sebanyak 20 g daging atau jeroan teripang dalam kondisi beku dan kering yang telah dihomogenkan diblender, ditambahkan 45 ml aseton dingin, kemudian disimpan selama 24 jam dalam ruang dingin. Selanjutnya disentrifugasi pada 5000 rpm selama 15 menit. Endapan yang diperoleh dipisahkan dari fase cairnya. Fase cairnya kemudian diuapkan dalam penangas air (water bath) pada suhu 40oC. Residu yang diperoleh diekstraksi dua kali dalam larutan etil asetat, kloroform dan air (1:1:1) dengan menggunakan corong pemisah sehingga terbentuk dua lapisan. Pelarut pengekstrak kemudian diuapkan pada penangas air pada suhu 40oC. Ekstrak tersebut kemudian digunakan untuk identifikasi keberadaan steroid, fraksinasi dengan TLC dan filtrasi membran serta bioassay.
2) Identifikasi Keberadaan Steroid
Identifikasi steroid dalam teripang dilakukan dengan uji Lieberman-Burchard yaitu dengan penambahan beberapa tetes asam asetat anhidrat
dan 0,5 ml khloroform pada ekstrak teripang, kemudian diaduk. Selanjutnya ditambahkan satu tetes asam sulfat pekat. Jika terbentuk warna hijau berarti ekstrak tersebut mengandung steroid (Cook 1958; Bahti et al. 1983; Harborne 1987).
Pemisahan steroid dilakukan dengan teknik TLC. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut:
1. Sampel, beberapa fraksi standar dan lempeng tipis silika gel 60 F254 katalog Art 5554 dengan ukuran panjang 10 cm dan lebar 5 cm disiapkan. Sampel dan semua fraksi standar diambil sedikit (0,35 g) kemudian dilarutkan kedalam 1,5 ml khloroform.
2. Eluen yang digunakan adalah etanol dan kloroform dengan perbandingan 3 : 7. Eluen dimasukkan ke dalam tabung kromatografi hingga 2 cm tingginya dari dasar tabung dan diletakkan dengan kertas saring kemudian ditutup rapat agar jenuh dengan uap eluen.
3. Larutan ekstrak sampel diteteskan dengan pipa kapiler pada lempeng silika gel. Penetesan dilakukan pada jarak 1 cm dari salah satu ujung lempeng tersebut. Di lain tempat diteteskan juga beberapa standar steroid yang disediakan.
4. Ujung lempeng yang terdekat pada tempat penetesan dicelupkan ke dalam tabung kromatografi yang sudah jenuh dengan eluen. Kemudian ditutup rapat dan dibiarkan pelarut naik sampai batas yang ditentukan.
5. Setelah dielusi pada batas tertentu, lempeng tersebut diangkat dan selanjutnya dikeringkan dalam oven selama beberapa menit.
6. Lempeng langsung dideteksi dengan sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
3) Filtrasi Steroid dengan Membran Nanofiltrasi
Ekstrak teripang yang didapat selanjutnya difiltrasi dengan membran nanofiltrasi yang mempunyai selektivitas untuk steroid. Permeat yang dihasilkan merupakan bioaktif target kemudian diamati kemurniannya secara kualitatif dengan uji Liebermann-Burchard.
4) Pengukuran Kadar Testosteron dan Kolesterol dari Serum Darah Pengukuran kadar testosteron dan kolesterol dalam serum darah anak ayam jantan dilakukan dengan menggunakan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC). Prosedur pengukuran dilakukan seperti berikut ini
(Kurečková et al. 2002).
Prinsip prosedurnya didasarkan pada deteksi testosteron dan kolesterol sampel pada panjang gelombang 240-242 nm. Analisis dilakukan dengan menggunakan sistem HPLC yang terdiri dari beberapa peralatan, seperti: pompa LCP 4000 Ecom bertekanan tinggi (Praha, Republik Cekoslovakia), gradient
programmer GP 5 Ecom, kolom pengaman C18, 4 mm L x 3 mm I.D.
Phenomenex (Torrance, CA, USA). Prosedur pengukuran selengkapnya adalah sebagai berikut:
1. Dipersiapkan kolom HPLC analitik 125 x 4 mm dengan LiChrospher 100 RP-18e 5 µm (Merck) dengan detektor UV pada panjang gelombang 240-242 nm.
2. Dipersiapkan tabung ke-A, B, C, D, E dan F serta duplonya untuk sampel serum darah yang akan dianalisis.
3. Dipipet 50 μl dari setiap sampel ke dalam tabung sampel yang telah ditentukan (sampel pertama ke dalam tabung pertama, sampel kedua ke dalam tabung kedua dan seterusnya). Masing-masing duplo.
4. Sebanyak 20 µl dari masing-masing sampel diinjeksikan.
5. Laju alir fase gerak adalah 0,7 ml/menit dan pemisahan dicapai dengan menggunakan gradien pemisah (sequence), yaitu pelarut yang digunakan adalah metanol-air dengan komposisi yang diatur dari 45:55 (v/v) sampai 85:15 (v/v) selama 15 menit.
6. Steroid dideteksi pada panjang gelombang 240 nm dan 242 nm.
5) Analisis Kadar N Bahan Contoh (Bubuk Teripang dan Feses)
Analisis kadar N dilakukan dengan metoda makro-kjeldahl (Sudarmadji et
al. 1984). Satu gram contoh (=x) ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam labu
destruksi dan ditambahkan sebanyak 6 gram katalis (campuran selen) serta 25 ml H2SO4 pekat (teknis) dan dicampur sampai homogen. Campuran tersebut dipanaskan (mulai dengan nyala kecil) diatas nyala pembakar bunsen di dalam lemari asam. Bila tidak berbuih lagi, barulah nyala diperbesar. Sampel terus didestruksi hingga larutan jernih dan berwarna hijau.
Setelah itu labu destruksi didinginkan dan larutan dimasukkan ke dalam labu penyuling dan diencerkan dengan 300 ml air. Selanjutnya ditambah beberapa butir batu didih dan larutan dijadikan basa dengan menambahkan kira-kira 100 ml NaOH 33%, labu dipasang dengan cepat ke alat penyuling. Sulingan (NH3 dan air) ditangkap dalam satu labu erlenmeyer yang terlebih dahulu telah diberi sejumlah H2SO4 dengan titrasi tetentu (misalnya 0,3 N) yang jumlahnya tergantung pada banyaknya N yang terikat dan 2 tetes indikator campuran.
Penyulingan diteruskan, hingga semua N dari cairan tertangkap oleh H2SO4 yang ada dalam labu erlenmeyer (bila 2/3 dari cairan dalam labu penyuling telah menguap). Labu erlenmeyer berisi sulingan diambil dan dititar kembali dengan standar NaOH dengan titar tertentu (0,1 N) = Z ml. Perubahan warna dari biru ke hijau menandakan titik akhir. Selanjutnya nilai titar dibandingkan dengan titar blanko = Y ml.
( Y – Z ) x titar x 0,014 x 6.25 x 100% Z
6) Analisis Serapan N pada Anak Ayam
Analisis serapan N pada anak ayam dilakukan dengan metode makro-kjeldahl (Sudarmadji et al. 1984). Sebelumnya ayam dipuasakan selama 12 jam. Pakan yang akan diberikan ditimbang dahulu. Pakan ini diberikan untuk konsumsi selama 24 jam. Selama 24 jam tersebut fesesnya ditampung, kemudian ditimbang. Dilakukan pengeringan dengan oven, kemudian digerus. Jumlah N yang terdapat dalam feses tersebut dianalisis seperti cara di atas.
%N Pakan - % N Feses x 100% % N Pakan
7) Analisis Kadar Lemak pada Bubuk Teripang
Analisis kadar lemak dilakukan dengan metode yang dilaporkan oleh Sudarmadji et al. (1984). Labu penyari dengan beberapa butir batu didih di dalamnya, dikeringkan dalam alat pengering pada suhu 105-110ºC selama 1 jam. Selanjutnya labu penyari didinginkan dalam eksikator, kemudian ditimbang = a gram. Ditimbang sebanyak 5 gram contoh = X gram (banyak sedikitnya contoh yang ditimbang tergantung pada kadar lemak bahannya) lalu dimasukkan
Kadar N =
ke dalam selongsong penyari (dapat juga digunakan kertas saring yang dibuat seperti kantong yang ditutup dengan kapas yang tidak berlemak).
Selongsong penyari dimasukkan ke dalam alat soxhlet dan diekstrak dengan eter minyak tanah, etil eter atau kloroform di atas penangas air (water
bath). Setelah ekstraksi selesai (24-48 jam sampai eter minyak tanah di dalam
soxhlet jernih) labu penyari dibuka dan dikeringkan untuk menghilangkan eter minyak tanah secepat mungkin. Kemudian labu penyari dikeringkan dalam alat pengering pada suhu 105-1100C selama 1 jam.
Selanjutnya labu penyari didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Pekerjaan mengeringkan dan menimbang diulangi, hingga tercapai bobot yang tetap (b gram).
b - a X
8) Karakterisasi Senyawa Steroid dari Ekstrak Teripang
Karakteristik ekstrak steroid dari teripang yang diamati adalah warna, derajat keasaman (pH), kelarutan, stabilitas, antibakteri dan antifungi. Warna ekstrak diamati secara visual dan pH diukur dengan menggunakan pH-meter. Kelarutan ekstrak steroid diamati dengan menggunakan pelarut aseton, etil asetat, kloroform, metanol dan air.
Pengujian stabilitas ekstrak steroid dari teripang dilakukan berdasarkan aktivitas antibakterinya setelah penyimpanan selama 10 bulan pada temperatur + 10oC. Pengujian aktivitas antibakteri dan antifungi dijelaskan seperti di bawah ini sebagaimana metode yang digunakan oleh Institute of Marine Biotechnology, Greifswald-Jerman.
a. Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar (agar diffusion assay). Biakan bakteri uji diambil sebanyak dua ose kemudian
disuspensikan pada larutan buffer sebanyak 2 ml. Sebanyak 200 µl dari suspensi bakteri uji tersebut dimasukkan ke dalam 20 ml media agar yang masih cair lalu digoyang secara perlahan agar homogen. Selanjutnya media agar tersebut dituangkan ke dalam cawan petri yang steril dan dibiarkan pada suhu kamar dalam keadaan aseptik sampai media agar membeku. Setelah agar membeku, diletakkan di atasnya paper disc yang telah ditetesi ekstrak steroid. Paper disc yang digunakan berdiameter 6 mm.
Media agar yang telah membeku kemudian disimpan di refrigerator selama dua jam dengan posisi terbalik. Selanjutnya media agar diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37oC dengan posisi terbalik. Setelah diinkubasi aktivitas bakteri dapat diamati yaitu dengan mengukur diameter hambatan yang terbentuk di sekeliling paper disc. Besarnya diameter hambatan yang terbentuk diukur dalam mili meter.
b. Antifungi (antikapang)
Fungus (kapang) yang digunakan dalam uji aktivitas antikapang adalah Candida maltosa. Pengujian aktivitas antikapang dilakukan sebagaimana pengujian aktivitas antibakteri, hanya saja inkubasi dilakukan pada posisi tidak terbalik.
9) Uji Aktivitas Biologis/Bioassay pada Anak Ayam Jantan (Alwir 2001) Sebelum perlakuan, anak ayam jantan divaksinasi ND (New Castle
Disease) secara tetes hidung dan ditimbang bobot badannya kemudian diukur
panjang, lebar dan tinggi jengger. Anak ayam jantan diletakkan dalam kandang percobaan yang dilengkapi dengan lampu listrik 25 watt. Sebelum perlakuan, anak ayam jantan dibiarkan beradaptasi di dalam kandang selama seminggu. Dalam setiap kandang terdapat enam ekor anak ayam jantan yang masing-masing mendapat perlakuan yang sama.
Pemberian perlakuan ekstrak steroid dan kontrol pada anak ayam jantan dilakukan secara oral setiap hari selama 18 hari pengamatan dimulai dari umur 10 hingga 27 hari. Selama beradaptasi dan pemberian pakan, masing-masing anak ayam diberi ransum yang sama dan air minum secara ad libitum (tidak terbatas). Pemberian ransum bebas sterol dan air minum ini dilakukan dengan cara menaruhnya dalam tempat-tempat yang diikatkan dalam kandang.
Setiap hari anak ayam jantan ditimbang bobot badannya dan tiap dua hari sekali diukur panjang, lebar dan tinggi jenggernya. Proses pengukuran jengger hewan percobaan dapat dilihat pada Lampiran 1.
Pada hari ke-28 hingga ke-30 dilakukan pengamatan serapan N, dimana dua ekor anak ayam dari masing-masing perlakuan ditempatkan secara terpisah pada kandang yang dilengkapi dengan alas untuk menampung feses anak ayam tersebut. Pada hari ke-31, anak ayam disembelih dan diambil darahnya dari leher. Selanjutnya anak ayam dibedah dan diambil jengger, hati, limpa, bursa fabrisius dan testisnya, kemudian ditimbang. Serum darah dipersiapkan untuk pengukuran kadar kolesterol dan testosteron. Secara garis besar, kerangka kerja penelitian yang dilakukan diperlihatkan pada Gambar 6 berikut ini.
Gambar 6 Kerangka kerja penelitian (Modifikasi dari Alwir 2001) Pemisahan Bagian-bagian Teripang Daging Jeroan Homogenisasi Ekstraksi I ( suhu 4oC, 24jam) Sentrifugasi (5.000 rpm, suhu 4oC, 15 menit) Supernatan (Diuapkan) Presipitat Ekstraksi II (suhu 4oC, 24 jam) Rafinat (Fase atas) Filtrasi membran NF (1000 Da) Bioassay TLC/HPLC Ekstrak (Fase bawah) Aseton Kloroform, etil asetat, air (1:1:1) Teripang