BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
4.7 Prosedur Penelitian
A.vera dicuci bersih (Gambar 16), lalu ditimbang sebanyak 1015,5 gram (Ohyo JP2 6000, Japan) (Gambar 17), kemudian diiris tipis + 2 mm (Gambar 18), disusun dalam cawan freeze dryer (Gambar 19a dan b), dan dimasukkan ke dalam
freeze dryer (Edwards, USA) (Gambar 20c) untuk pengeringan beku selama 48 jam dengan suhu -300 C dan tekanan 2 atm. Diperoleh 28,2 gram A.vera kering (Gambar 21a), kemudian diblender hingga menjadi serbuk (Gambar 21c).
Berikutnya dilakukan prosedur maserasi. Pertama, Serbuk A.vera kering (28,2 gram) yang telah diblender dimasukkan kedalam erlenmeyer ukuran 1 L (Gambar 22a), dan ditambahkan etanol 96% sebanyak 600 ml (Gambar 22b), didiamkan selama 2 hari sambil digoncang-goncangkan satu kali sehari (Gambar 22c). Setelah 2 hari disaring dengan menggunakan kertas saring biasa (Gambar 23a dan b) melalui corong buchner (mainz, Schoott) dan diperoleh ekstrak cair sebanyak 380 ml (Gambar 23c).
Selanjutnya, ampas serbuk A.vera dimaserasi kembali (remaserasi) selama 2 hari dengan menambahkan etanol sebanyak 350 ml (Gambar 24a), ini dilakukan sebanyak dua kali dengan menambahkan etanol dengan jumlah yang sama, yaitu 350 ml (total lamanya maserasi = 6 hari) dan diperoleh ekstrak cair kembali (Gambar 24b). Sehingga total ekstrak cair adalah 880 ml. Seluruh ekstrak cair yang diperoleh kemudian diuapkan dengan menggunakan rotavapor (Buchi R-200, Switzerland) selama 3 jam (Gambar 25), sehingga diperoleh 6,6 gram ekstrak kental A.vera.
Selanjutnya ekstrak disimpan dalam wadah kaca tertutup berwarna terang (Gambar 38). Alur ekstraksi A.vera dapat dilihat pada Lampiran 1.
a b
Gambar 16. Daun A.vera dicuci bersih Gambar 17. Penimbangan daun A. vera sebanyak 1015,5 gram
Gambar 18. Daun A.vera diiris tipis (tebalnya + 2 mm)
c b a a c b b c a
Gambar 22. Prosedur maserasi, Serbuk A.vera dimasukkan kedalam erlenmeyer 1 L (a), ditambahkan etanol 600 ml (b), didiamkan selama 2 hari sambil digoyang-goyangkan (c)
Gambar 20. Cawan disusun didalam freeze dryer (a), ditutup dengan tabung penutup freeze dryer (b) untuk proses pengeringan beku selama 48 jam (c)
Gambar 23. Setelah 2 hari disaring (a dan b) dan diperoleh ekstrak cair sebanyak 380 ml (c) b c a b a
Gambar 24. Ampas serbuk A.vera dimaserasi kembali selama 2 hari (a) dan diperoleh ekstrak cair kembali (b)
4.7.2 Uji Screening FitokimiaEkstrak A.vera
Tujuan: untuk mengetahui ada/tidaknya kandungan antrakuinon, saponin, dan tanin dalam bahan uji ekstrak A.vera dan ampas ekstrak A.vera dengan pelarut etanol 96%.
4.7.2.1 Uji Senyawa Saponin
5 tetes ekstrak kental A.vera dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu tambahkan 5 ml air panas, dinginkan. Kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit atau tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl 2N berarti ada saponin.
4.7.2.2 Uji Senyawa Tanin
Ekstrak kental A.vera 5 tetes ditambahkan 2 tetes FeCl3 1%. Jika terjadi warna
biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin. Ekstrak kental
A.vera 5 tetes sebelumnya dicairkan dengan penambahan aquades + 5 tetes.
a b
Gambar 26. a. Ekstrak A.vera, b. Ampas ekstrak A.vera
4.7.2.3 Uji Senyawa Antrakuinon
Ekstrak kental A.vera 2 tetes ditambah 2,5 ml H2SO4 2N dipanaskan sebentar,
setelah dingin ditambah 5 ml benzene, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzene dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzene dengan 1 ml NaOH 2N, diamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzene tidak berwarna menunjukkan adanya antrakuinon.
Ketiga uji senyawa ini dilakukan juga pada ampas ekstrak A.vera dengan prosedur yang sama untuk membuktikan bahwa tidak ada lagi kandungan saponin, tanin, dan antrakuinon yang tertinggal.
4.7.3 Pembuatan Suspesni Bahan Uji
Pembuatan bahan uji ekstrak etanol A.vera dimulai dari konsentrasi 100% karena belum diketahui konsentrasi ekstrak etanol A.vera yang menimbulkan efek sitotoksik pada sel fibroblas (BHK-21). Ekstrak etanol A. vera disuspensikan dengan media Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) dengan perbandingan 1 gram/1 ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran bahan secara dilusi (pengenceran ganda) dengan mengambil setengah dari ekstrak 100% dan ditambahkan 0,5 ml media RPMI untuk mendapatkan konsentrasi 50%. Kemudian diambil lagi setengah dari konsentrasi 50% dan ditambah 0,5 ml RPMI untuk mendapatkan konsentrasi 25%, begitu seterusnya hingga diperoleh konsentrasi 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, dan 0,78%.
4.7.4 Uji Sitotoksisitas
Semua pekerjaan dilakukan dalam Laminar flow. Kultur sel BHK-21 dalam bentuk cell-line ditanam dalam botol roux selama 4 hari. Setelah itu kultur sel dipanen menggunakan trypsine versene solution. Hasilnya kemudian ditanam pada media Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) yang terdiri dari 10% serum albumin fetal bovine yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370 C (Gambar 27). Selanjutnya sel fibroblas didistribusikan pada setiap 96 sumuran (well)
microplate (Gambar 28a dan b).
Setiap sumuran terdiri dari sel dan media RPMI dengan kepadatan 75 x 104 sel/ml dalam 150 µl dan masing-masing diberikan larutan ekstrak A.vera pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78% (8 sampel) sebanyak 25 µl (bahan uji tersebut sebelumnya telah disterilisasi dengan cara filltrasi dengan kertas saring (Millipore, USA) ukuran pori-pori 0,45 µm) dengan waktu kontak bahan uji selama 24 jam(Gambar 31). Begitu juga dengan Ca(OH)2 disiapkan
dengan konsentrasi 100% (1gr/1ml) dan diambil supernatantnya saja sebanyak 25 µl.
Microplate diinkubasi kembali pada suhu 370 C selama waktu kontak (Gambar 32), kemudian pindahkan dari inkubator.
Kontrol sel disiapkan, dan dianggap persentase sel hidupnya adalah 100%. Kontrol media dianggap persentase sel hidupnya 0%. Selanjutnya, garam tetrazolium
(MTT) dilarutkan dalam Phosphate-Buffered Saline (PBS) 5 mg/mL. MTT ditambahkan secara langsung pada plate yang berisi medium kultur sebanyak 10 μl (Gambar 33), kemudian diinkubasi kembali selama kurang lebih 4 jam pada suhu 370C suasana CO2 5%. Seluruh media dalam sumuran dan bahan uji diambil.
Kemudian, setiap sumuran ditambahkan DMSO (Dimethylsufoxide) sebanyak 50 μl (Gambar 35). Plate diaduk secara mekanis dengan Plate Shaker sampai kristal formazan terlarut + 10 menit (Gambar 36). Sel fibroblas yang hidup akan terwarnai dengan formazan menjadi biru (Gambar 45), sedang yang mati tidak terbentuk warna biru.
Selanjutnya, formazan dibaca absorbansinya secara spektrofotometri dengan
ELISA reader pada panjang gelombang 620 nm (Gambar 37b). Hitung rata-rata persentase kehidupan sel dari nilai Optical density (absorbansi) masing-masing sampel pada setiap konsentrasi terhadap nilai kontrol. Buat grafik persentase kehidupan sel terhadap kelompok perlakuan dan kontrol. Nilai IC50 selanjutnya dapat
ditentukan dari nilai rata-rata persentase kehidupan sel. Alur uji sitotoksisitas dapat dilihat pada Lampiran 2.
Persentase kehidupan sel dihitung menggunakan rumus yang digunakan oleh Christian Khoswanto (UNAIR, 2008) sebagai berikut:27
Rumus Umum:
Keterangan:
% kehidupan sel : persentase jumlah kehidupan sel setelah uji
Grup tes : nilai OD (Optical density) formazan setiap sampel setelah tes Media : nilai OD (Optical density) formazan pada kontrol media Sel : nilai OD (Optical density) formazan pada kontrol sel
% Kehidupan sel = Grup tes + media x 100% Sel + media
Gambar 27. Kultur cell lines BHK-21 dengan media RPMI-1640
Gambar 28a. Sel fibroblas didistribusikan kedalam 96-well microplate
Gambar 31. Bahan uji dimasukkan ke dalam sumuran 25 μl/konsentrasi Gambar 30. Siapkan bahan uji
Gambar 29. Kontrol sel diperiksa dengan microscope inverted Gambar 28b. Sel fibroblas dalam 96-well
Gambar 33. MTT dilarutkan dalam PBS 5 mg/ml dan ditambahkan langsung pada plate yang berisi sel fibroblas sebanyak 10 μl dan diinkubasi selama 4 jam
Gambar 32. Inkubasi dengan suhu 370C suasana CO2 5%