METODE PENELITIAN
2. Kriteria Eksklusi
3.6 Prosedur Penelitian
5. Pakan tikus 6. Air minum 7. Handscoen 8. Masker
9. Bahan-bahan untuk pengamatan mikroskop
3.6 Prosedur Penelitian
3.6.1 Pengadaan Hewan Uji
Hewan uji berupa tikus putih jantan galur sprague dawley berjumlah 25 ekor diperoleh dari Palembang Tikus Centre (PTC).
3.6.2 Pemeliharaan Hewan Uji
Hewan uji tikus putih jantan galur sprague dawley akan menjalani masa adaptasi selama 1 minggu di kandang pemeliharaan untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya sebelum diberi perlakuan. Tikus ditempatkan di kandang pemeliharaan dengan tutup terbuat dari kawat dan dialasi oleh sekam padi setebal 0,5-1cm dan diganti setiap hari untuk mencegah terjadinya infeksi. Dalam 1 kelompok, 5 ekor tikus ditempatkan dalam 1 kandang. Suhu dijaga pada suhu 250C, lingkungan kandang dijaga agar tidak lembab dan diberikan pencahayaan yang cukup. Pemberian makanan dan minuman melalui ad libitum. Makanan tikus diberikan berupa pelet. Pemberian makanan dan minuman diberikan secukupnya dengan wadah terpisah dan diganti setiap hari untuk menjaga kesehatan tikus agar tidak sakit atau mati.
35
3.6.3 Pembuatan Puree Tomat
Puree merupakan produk serupa dengan bubur yang memiliki viskositas atau kekentalan sedang. Puree diolah dengan cara memasak bubur atau slurry daging buah tomat sampai diperoleh kekentalan yang diinginkan. Penelitian yang dilakukan oleh badan pangan dunia FAO-WHO menunjukan bahwa selama pemanasan, kandungan likopen tidak akan rusak dan jumlahnya tidak jauh berubah. Oleh karena itu, pada penelitian ini menggunakan tomat dengan cara direbus atau dikukus.
Alat yang digunakan dalam pembuatan puree tomat : a) Pisau
b) Saringan c) Blender d) Baskom e) Panci
f) Wadah / cup gelas g) Sealer
Bahan yang digunakan dalam pembuatan puree tomat : a) Tomat 1-2 kg
b) Gula pasir 5% (b/v)
Cara pembuatan puree tomat :
36
b) Buah tomat dibelah menjadi 2 bagian. Biji dan air pada bagian dalam buah tomat dibuang
c) Daging buah tomat dipanaskan pada suhu 1000C selama kurang lebih 3 menit
d) Tiriskan daging buah tomat, kemudian kelupas kulitnya
e) Daging buah tomat dihancurkan dengan blender hingga menjadi bubur tomat
f) Bubur tomat atau slurry ditambahkan dengan gula secukupnya sesuai selera
g) Campuran slurry dimasak dengan api kecil dan diaduk hingga mengental (kurang lebih selama 15-20 menit)
h) Puree yang telah jadi dan dingin siap untuk dikemas atau disimpan di pendingin.
Dosis tomat didapatkan dari perhitungan tiap 100 gram tomat rebus mengandung 9700µg likopen. Menurut penelitian (Sulistyowati, 2006), dosis likopen yang memberikan efek antioksidan pada tikus adalah 0,36mg/KgBB. Maka dari itu, dilakukan perhitungan dosis tomat rebus agar terkandung 0,36mg/KgBB likopen. Berikut ini hasil perhitungan dosis tomat untuk tikus.
X =
X = 3,71gr
37
Maka didapatkan dosis pertama adalah 3,7 gr, untuk kelompok P2. Dosis tersebut akan diturunkan setengah menjadi 1,85 gr untuk kelompok P1 dan dosis ketiga dinaikkan 2 kali lipat menjadi 7,4 gr untuk kelompok P3 yang masing-masing dilarutkan dalam 6 ml aquades.
3.6.4 Pemberian Zink
Zink yang digunakan dalam penelitian ini berupa zink serbuk. Angka kecukupan rata-rata zinc yang dianjurkan untuk dewasa per hari berdasarkan dosis harian manusia dengan golongan umur 10-59 tahun yaitu 15 mg. Setelah dikonversikan ke tikus menjadi 15 x 0,018= 0,27 mg. Dosis tersebut akan diturunkan setengah menjadi 0,135 mg dan dinaikkan 2 kali lipat menjadi 0,54 mg yang dilarutkan dalam 6 ml aquades.
3.6.5 Induksi Gelombang Elektromagnetik
Induksi paparan gelombang elektromagnetik dilakukan dengan cara meletakkan telepon seluler dalam keadaan menyala di tiap kandang tikus yang telah dimodifikasi khusus untuk paparan. Kandang modifikasi berbentuk tabung kawat dengan tinggi 30 cm dan diameter 30 cm. Pada bagian tengah kandang dibuat sebuah lubang sebagai tempat untuk meletakkan telepon seluler sebagai sumber gelombang elektromagnetik. Telepon seluler kemudian dihubungi menggunakan telepon lain. Telepon seluler tersebut lalu diaktifkan dan dibiarkan dalam keadaan talk mode.
38
3.6.6 Proses Pembedahan a. Pembedahan
Setelah 35 hari perlakuan, masing-masing hewan coba diterminasi dengan cara diinjeksikan ketamin.Kemudian, mempersiapkan alat bedah (bak paraffin, gunting, pinset, jarum, gelas arloji) yang digunakan.
b. Pengambilan, Penimbangan dan Pengukuran Testis
Setelah selesai proses pembedahan, dilakukan pengambilan bagian testis dengan menggunakan pinset. Kemudian, testis tikus diletakkan pada gelas ukur berisi NaCl agar dapat dengan mudah memisahkan testis dengan lemak.
3.6.7 Pengambilan dan Pengamatan Spermatozoa
Setelah dilakukan proses pembedahan, selanjutnya dilakukan prosedur sebagai berikut :
1. Pengambilan Sekresi Kauda Epididimis
Di bawah mikroskop bedah dengan pembesaran 400 kali kauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proksimal korpus epididimis dan bagian distal vas deferen. Selanjutnya kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9%, kemudian bagian proksimal kauda dipotong sedikit dengan gunting lalu kauda ditekan dengan perlahan hingga cairan sekresi epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9%. Suspensi spermatozoa dari cauda epididimis yang telah diperoleh dapat
39
digunakan untuk pengamatan yang meliputi motilitas dan morfologi spermatozoa.
2. Motilitas spermatozoa
Untuk menentukan motilitas spermatozoa diambil spermatozoa dari kauda epididimis seperti penjelasan di atas kurang lebih 10-15 μl ke atas gelas objek dengan ukuran 25,4 mm x 76,2 mm lalu ditutup dengan cover glass 22 mm x 22 mm. dilakukan pengamatan pada 5 lapang pandang pada pembesaran mikroskop 400x.
Perhitungan motilitas spermatozoa dilakukan dengan menghitung persentase spermatozoa di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 100 kali, dihitung yang pergerakannya progresif maju ke depan dibandingkan dengan seluruh teramati (bergerak dan tidak bergerak) kemudian dikali dengan 100%.
%motilitas =
x 100%
3. Morfologi spermatozoa
Untuk menentukan morfologi spermatozoa diambil spermatozoa dari kauda epididimis seperti penjelasan di atas, kemudian dibuat apusan menggunakan kaca objek, lalu dikeringkan. Kemudian diberi alkohol 70% selama 15 menit dikeringkan kemudian diberi pewarna giemsa selama 15 menit. Setelah itu dibilas dengan aquades lalu dikeringkan. Kemudian di bawah mikroskop cahaya dihitung dengan
40
jumlah 100 spermatozoa, ditentukan presentase spermatozoa normal dan abnormal (WHO).
Ciri morfologi spermatozoa normal yaitu memiliki bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus. Sedangkan morfologi spermatozoa abnormal yaitu memiliki bentuk kepala tidak beraturan amorphous, berbentuk seperti pisang, atau terlalu bengkok dan ekor tidak lurus bahkan tidak berekor atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala.
