METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi Penelitian
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1. Pembuatan Larutan Natrium klorida dalam 100 ml
Dikalibrasi botol 100 ml. Ditimbang 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20;
22,5; 25; 27,5; dan 30 gram natrium klorida kemudian dilarutkan dengan aquades hingga diperoleh volume total sebanyak 100 ml. Kemudian larutan Natrium klorida disterilkan dengan menggunakan autoklaf dengan suhu 121°C selama 15 menit (Amriani, 2015).
3.5.2 Pembuatan Media Bakteri Uji 3.5.2.1 Nutrient Agar (NA)
Sebanyak 28 gram serbuk Nutrient Agar dilarutkan dalam akuades sedikit demi sedikit lalu diaduk sampai seluruh serbuk larut dengan bantuan pemanasan hingga volumenya 1 L, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Difco Laboratories, 1997; Poernomo, 2013).
3.5.2.2 Nutrient Broth (NB)
sebanyak 13 gram serbuk Nutrient Broth dilarutkan dalam akuades sedikit demi sedikit lalu diaduk sampai seluruh serbuk larut hingga volumenya 1 L, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Difco
3.5.2.3 Plate Count Agar (PCA)
Sebanyak 24 gram serbuk Plate Count Agar dilarutkan dalam akuades sedikit demi sedikit lalu diaduk sampai seluruh serbuk larut dengan bantuan pemanasan hingga volumenya 1 L, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Himedia, 2018; Widyastuti, 2019).
3.5.2.4 Mannitol Salt agar (MSA)
Sebanyak 111 gram serbuk Mannitol Salt Agar dilarutkan dalam akuades sedikit demi sedikit lalu diaduk sampai seluruh serbuk larut dengan bantuan pemanasan hingga volumenya 1 L, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Humeau Laboratoires, 2016; Oxoid).
3.5.2.5 Blood Agar (BA)
Sebanyak 40 gram serbuk Blood Agar dilarutkan dalam akuades sedikit demi sedikit lalu diaduk sampai seluruh serbuk larut dengan bantuan pemanasan hingga volumenya 1 L, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit kemudian dimasukkan 7% darah domba steril pada suhu 50°C secara aseptis (Ginting, 2020; Oxoid).
3.5.3 Pembuatan Agar Miring
Dituangkan media Nutrient Agar yang telah dibuat sebanyak 5 ml pada tabung reaksi steril dan ditutup dengan alumunium foil. Media tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit, kemudian dibiarkan pada suhu ruangan dan letakkan dengan posisi 45° sampai media memadat. Media Agar miring digunakan untuk inokulasi bakteri (Handayani, 2016; Yusmaniar, 2017).
3.5.4 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam pengujian antibakteri harus disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan menggunakan oven
dengan suhu 170°C selama 1 jam. Untuk media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose disterilkan dengan cara pemijaran dengan bunsen hingga berwarna merah bata (Fitriyanti, 2019; Yusmaniar,2017).
3.5.5 Pembuatan Stok Kultur 3.5.5.1 Staphylococcus aureus
Diambil sebanyak satu ose koloni bakteri Staphylococcus aureus dengan jarum ose steril, lalu ditanamkan pada media agar miring dengan cara menggores.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Cappuccino,2014;
Handayani, 2016).
3.5.5.2 Streptococcus sanguinis
Diambil sebanyak satu ose koloni bakteri Streptococcus sanguinis dengan jarum ose steril, lalu ditanamkan pada media agar miring dengan cara menggores.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Cappuccino,2014;
Handayani, 2016).
3.5.6 Pembuatan Larutan Mac Farland 0.5
Sebanyak 9,95 ml H2SO4 1% dicampur dengan 0,05 ml BaCl2 1% dan dikocok hingga homogen sehingga didapat kekeruhan sesuai standar McFarland 0,5. Selanjutnya larutan standar McFarland diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm dengan kerapatan bakteri 25% atau setara dengan 1,5 x 108 CFU/ml (Mc Farland, 1907;
ProLabDiagnostic, 2012; Silvia, 2015).
3.5.7 Identifikasi Bakteri
3.5.7.1 Identifikasi Bakteri Staphylococcus aureus
Diambil sebanyak satu ose koloni bakteri Staphylococcus aureus dengan
diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam (Hayati, 2019; Oxoid).
3.5.7.2 Identifikasi Bakteri Streptococcus sanguinis
Diambil sebanyak satu ose koloni bakteri Streptococcus sanguinis dengan jarum ose steril, lalu digores pada media BA (Blood Agar). Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam (Wilson, 2017; Oxoid).
3.5.8 Pembuatan Inokulum Bakteri 3.5.8.1 Suspensi Staphylococcus aureus
Diambil sebanyak satu ose koloni bakteri Staphylococcus aureus pada media agar miring dengan menggunakan jarum ose yang telah disterilkan sebelumnya kemudian disuspensikan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 10 ml larutan Nutrient Broth (NB). Kemudian tabung reaksi yang telah berisi suspensi bakteri divortex agar homogen kemudian tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam kemudian disesuaikan dengan Standart Mac Farland 0,5 (Cappuccino, 2014; Dwicahyani, 2018)
3.5.8.2 Suspensi Streptococcus sanguinis
Diambil sebanyak satu ose koloni bakteri Streptococcus sanguinis pada media agar miring dengan menggunakan jarum ose yang telah disterilkan sebelumnya kemudian disuspensikan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 10 ml larutan Nutrient Broth (NB). Kemudian tabung reaksi yang telah berisi suspensi bakteri divortex agar homogen kemudian tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam kemudian disesuaikan dengan Standart Mac Farland 0,5 (Cappucino,2014; Dwicahyani, 2018).
3.5.9 Pengujian Aktivitas Antibakteri Larutan Natrium Klorida terhadap Staphylococcus aureus dan Streptococcus sanguinis
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap larutan natrium klorida dengan berbagai konsentrasi. Pengujian dilakukan dengan metode dilusi yaitu dengan pengukuran transmitan, pengujian visual dan AOAC 960.09.
3.5.10 Pengujian Pengukuran Transmitan
Disiapkan tabung reaksi yang telah disterilkan dan kemudian diberi label pada tabung reaksi (Natrium Klorida 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20; 22,5;
25; 27,5; 30% dan Povidon Iodium) semua tabung reaksi yang telah berisi 9,9 ml larutan natrium klorida kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri. lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian diukur transmitannya sebelum dan sesudah inkubasi pada spektrofotometer UV-VIS dengan panjang gelombang 600 nm kemudian dilihat kenaikan dan penurunan Persen transmitannya. Jika terjadi penurunan transmitan berarti terjadinya pertumbuhan bakteri dan jika terjadi kenaikan transmitan berarti terjadinya penghambatan pertumbuhan bakteri.
3.5.11 Pengujian Visual
Disiapkan tabung reaksi yang telah disterilkan dan kemudian diberi label pada tabung reaksi (Natrium Klorida 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20; 22,5;
25; 27,5; 30% dan Povidon Iodium) semua tabung reaksi yang telah berisi 9,9 ml larutan natrium klorida kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri. lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 3, 24 dam 48 jam. Kemudian dilihat ada atau tidaknya kekeruhan dari masing masing tabung reaksi. Jika terjadi kekeruhan berarti terjadinya pertumbuhan bakteri dan jika jernih berarti terjadinya penghambatan pertumbuhan bakteri.
3.5.11.1 Pengujian Kontrol Positif Povidon iodium
Dikarenakan pada pengujian visual povidon iodium kurang efektif maka dilakukan uji KHM yaitu dengan cara dimasukkan 9,9 ml Povidon iodium 1%
(Sediaan pasaran) ke dalam tabung reaksi. Kemudian diambil suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan Streptococcus sanguinis sebanyak 0,1 ml dan diletakkan kedalam tabung reaksi. kemudian dilakukan metode KBM (Konsentrasi Bunuh Minimal) dimana diambil 1 ml dari tabung reaksi kemudian diinokulasi pada media agar NA (Nutrient Agar) dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam kemudian diamati. adanya pertumbuhan bakteri berarti bersifat bakteriostatik, sedangkan apabila tidak ada pertumbuhan bakteri berarti bersifat bakterisidal.
3.5.12 Pengujian AOAC 960.09
3.5.12.1 Pengujian larutan Natrium Klorida pada AOAC 960.09 dengan waktu kontak 60, 90 detik dan 5 menit
Dicampurkan 9,9 ml larutan Natrium klorida 10, 20 dan 30% dengan 0,1 ml bakteri Staphylococcus aureus dan Streptococcus sanguinis. Kemudian setelah berkontak selama 60 detik, 90 detik dan 5 menit dari campuran tersebut dibuat pengenceran dari 10-1 sampai 10-6 dengan cara mengambil 1 ml campuran (Larutan Natrium klorida + bakteri) ditambah 9 ml aqua pro injeksi (=
pengenceran 10-1), dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml ditambah 9 ml Aqua Pro Injeksi (= pengenceran 10-2). Begitu selanjutnya sampai diperoleh pengenceran 10-6. Kemudian ambil 1 ml dari setiap pengenceran (10--5 dan 10-6) kemudian diinokulasikan pada cawan petri yang berisi PCA (Plate Count Agar). Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator. Dilihat ada tidaknya pertumbuhan koloni pada setiap masing-masing pengenceran. Koloni yang
tumbuh dicatat dan di hitung dengan colony counter, perhitungan persen pengurangan bakteri dapat dinyatakan dengan persen dan dihitung dengan rumus Persen reduksi (%) =
Adanya pengurangan jumlah bakteri menandakan adanya pengaruh larutan natrium klorida 10, 20 dan 30% terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Streptococcus sanguinis (AOAC, 2013).
3.5.12.2 Pengujian Blanko pada AOAC 960.09
Dicampurkan 9,9 ml larutan Aqua pro Injeksi dengan 0,1 ml bakteri Staphylococcus aureus dan Streptococcus sanguinis. Kemudian dari campuran tersebut dibuat pengenceran dari 10-1 sampai 10-6 dengan cara mengambil 1 ml campuran (Larutan Pengencer + bakteri) ditambah 9 ml aqua pro injeksi (=
pengenceran 10-1), dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml ditambah 9 ml Aqua Pro Injeksi (= pengenceran 10-2). Begitu selanjutnya sampai diperoleh pengenceran 10-6. Kemudian ambil 1 ml dari setiap pengenceran (10--5 dan 10-6) kemudian diinokulasikan pada cawan petri yang berisi PCA (Plate Count Agar). Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dalam inkubator.
3.5.13 Pemeriksaan organoleptis
Pemeriksaan organoleptis larutan Natrium klorida berupa uji yang menggunakan panca indra berupa bau, warna, rasa dan bentuk (Ambari, 2018).
3.5.14 Uji Massa Jenis
Ditimbang piknometer kosong dan penutupnya, kemudian catat. Setelah itu diisi piknometer dengan larutan Natrium Klorida 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5,dan 30% sebanyak 10 ml. kemudian catat piknometer yang kosong dan berisi. Kemudian hitung massa jenis Natrium Klorida dengan
menggunakan rumus =
(Badan Standardisasi Nasional, 2000).
3.5.15 Uji pH
Pemeriksaan pH dilakukan dengan menggunakan pH meter digital.
Sebelum dilakukan pengukuran, alat terlebih dahulu dikalibrasi dengan dapar standar 7,0. Pengukuran diawali dengan membilas elektroda menggunakan akuades dan kemudian dikeringkan. Selanjutnya elektroda di celupkkan kedalam larutan Natrium klorida. Tunggu hingga layar monitor hingga menunjukkan hasil yang konstan kemudian dicatat (Ambari, 2018).
3.5.16 Uji Viskositas
Diukur viskositas larutan Natrium klorida dengan menggunakan alat viskometer Brookfield. Wadah di isi 250 mL dengan larutan yang akan diuji lalu dipasang spindel nomor 1 (Nurdianti, 2020).
3.5.17 Uji Tekanan Osmotik
Ditutup corong osmometer dengan plastik selofan (membran semipermeabel), kemudian diikat kuat dengan karet. Isi beaker glass dengan menggunakan akuades sebanyak 250 ml. Kemudian dimasukkan larutan Natrium klorida konsentrasi 10, 20, dan 30% ke dalam corong penampung larutan hingga bibir atas corong penampung. Oleskan vaselin pada tutup pipa, kemudian tutup pipa skala ke dalam corong penampung. Jepit leher corong penampung larutan, kemudian letakkan diatas beaker glass yang telah diisi akuades kemudian hitung peningkatan ketinggian air pada 0, 3, 5, dan 10 menit.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN