BAB IV METODE PENELITIAN
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Pembuatan Ekstrak Ethanol Anggur
Pembuatan ekstrak ethanol anggur dilakukan di Laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Udayana Bali dengan cara sebagai berikut:
1. Sampel dihancurkan supaya ukurannya lebih kecil dan senyawa aktif mudah keluar.
2. Dilakukan maserasi selama 24 jam sambil diaduk pada jam pertama, jam ke 12 dan jam ke 24 agar sampel dan pelarutnya menyatu dengan optimal, dengan perbandingan sampel : pelarut ethanol adalah 1:5.
3. Setelah 24 jam didapatkan saringan filtrat dan ampas. Filtrat dievaporasi untuk menghilangkan ethanolnya sehingga didapatkan ekstrak.
4. Dosis yang diberikan kepada tikus sebesar 250 mg ekstrak anggur/200 g BB tikus atau sebanding dengan 1,25 gram buah anggur/200 g BB tikus.
4.7.2 Penentuan Jumlah Hari Perlakuan
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui pada hari keberapa terjadi penurunan jumlah osteoblas serta peningkatan jumlah osteoklas. Hewan yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) jantan yang sehat, usia 2,5-3 bulan sebanyak 8 ekor dan dibagi menjadi 4 kelompok. Masing-masing kelompok berjumlah 2 tikus.
1. Kelompok pertama adalah kelompok kontrol, dimana tikus tidak diberi perlakuan, kemudian dieuthanasia pada hari ke 15.
2. Kelompok kedua adalah kelompok perlakuan dengan aktivitas berlebih (renang) selama 14 hari, kemudian dieuthanasia pada hari ke 15.
3. Kelompok ketiga adalah kelompok perlakuan dengan aktivitas berlebih (renang) selama 21 hari, kemudian dieuthanasia pada hari ke 22.
4. Kelompok keempat adalah kelompok perlakuan dengan aktivitas berlebih (renang) selama 28 hari, kemudian dieuthanasia pada hari ke 29.
Setelah dilakukan pemeriksaan histopatologi, ternyata pemberian pelatihan fisik berlebih selama 28 hari terbukti dapat menurunkan jumlah osteoblast secara
nyata (P<0,05). Oleh karena itu ditetapkan bahwa pelatihan fisik berlebih dilakukan selama 28 hari (Sasanthi, 2015).
4.7.3 Pemilihan dan pemeliharaan hewan uji
Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) jantan yang sehat sebanyak 36 ekor. Tikus kemudian dibagi secara random menjadi 2 kelompok, dengan masing-masing kelompok berjumlah 18 tikus. Kandang yang digunakan untuk pemeliharaan tikus adalah kandang yang tidak mudah rusak dan tahan untuk proses pensterilan ulang hingga suhu mencapai 120°C ataupun pensterilan dengan bahan kimia. Kandang yang digunakan adalah kandang yang mudah terlihat dari luar serta tahan gigitan, sehingga hewan tidak mudah lepas. Makanan yang diberikan adalah yang memenuhi syarat, serta lingkungan yang sehat (Ngatidjan, 2006).
4.7.4 Prosedur perlakuan
1. Tikus putih (Rattus norvegicus) jantan sebanyak 36 ekor, sehat, berumur 2,5 - 3 bulan dengan berat badan 150-170 gram.
2. Sebelum penelitian dimulai, tikus diadaptasi selama 1 minggu di tempat penelitian untuk penyesuaian dengan lingkungan. Satu kandang berisi dua ekor tikus. Kandang dibersihkan setiap hari.
3. Pada hari ke 8, sampel tikus yang berjumlah 36 ekor dibagi atas 2 kelompok secara random dimana kelompok pertama (kelompok kontrol/P0) diberikan aquabidest dalam volume 1 ml, 1x/hari dan perlakuan berenang hingga overtraining dan kelompok kedua (kelompok perlakuan 1/P1) diberikan ekstrak etanol buah anggur dengan dosis 250mg/200g tikus/hari dalam volume 1 ml, 1x/hari secara oral dan perlakuan berenang hingga overtraining. Pemberian aquabidest dan ekstrak anggur dilakukan 1 jam sebelum overtraining.
4. Selama penelitian, hewan coba diberikan makanan dan minuman secara teratur, kebersihan dan kenyamanan kandang dijaga.
5. Setelah 28 hari perlakuan, keseluruhan kelompok tikuss dieuthanasia pada hari ke 29 menggunakan ketamin 0,3cc dan zylazine 0,3cc, diinjeksikan secara intracardial, kemudian dilakukan pembedahan.
6. Saat dibedah, tulang femur diambil, dibersihkan dan dicuci dengan NaCl 0,9%.
7. Setelah tulang bersih, dimasukkan ke dalam buffer formalin 10% selama 1x24 jam.
8. Sampel femur kemudian diserahkan di Laboratorium Histopatologi.
9. Sampel kemudian didekalsifikasi dengan Sodium citrate dan Acid formic selama 4 hari supaya lunak dan untuk mempermudah proses trimming (pemotongan).
4.7.5 Prosedur pembuatan preparat histopatologi
Pembuat preparat histopatologi tulang femur dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut (Kiernan, 2010):
1. Jaringan yang telah didekalsifikasi kemudian diiris (trimming) dengan ukuran 1 × 1 × 1 cm, kemudian dimasukkan dalam cassette jaringan.
2. Tindakan selanjutnya adalah dehidrasi dengan merendam sediaan tersebut ke dalam alkohol secara berturut-turut dengan konsentrasi alkohol 70%, 80%, 90%, alkohol absolut I, alkohol absolut II dengan lama waktu masing-masing perendaman adalah ± 2 jam.
3. Selanjutnya dilakukan clearing untuk membersihkan sisa alkohol dari jaringan. Agen yang digunakan pada proses clearing adalah xylene. Setelah dibersihkan, jaringan siap untuk dimasukkan ke dalam blok parafin.
4. Langkah berikutnya ialah embedding dan blocking. Organ ditanam pada blok parafin yang telah disediakan kemudian disimpan dalam lemari es selama 24 jam.
5. Blok-blok parafin tersebut kemudian dipotong (cutting) dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4-5 μm.
6. Hasil pemotongan diapungkan dalam waterbath dengan suhu air 60oC untuk menghindari terjadi lipatan irisan jaringan setelah pemotongan. Sediaan diangkat dan diletakkan pada gelas objek.
4.7.6 Prosedur pewarnaan (Gill, 2010)
Deparafinisasi yaitu merendam preparat diatas gelas objek dalam xylol I, xylol II, xylol III selama masing-masing 5 menit.
Rehidrasi dengan tujuan untuk memberikan air pada jaringan yaitu dengan cara merendam preparat dalam larutan alkohol absolut lalu dipindahkan ke larutan alkohol 95% dengan durasi masing-masing 5 menit, lalu dibilas dengan air mengalir selama 1 menit.
Preparat kemudian direndam dalam larutan Hematoxylin Eosin Staining selama 15 menit.
Celupkan ke dalam aquades selama 1 menit dengan cara mengangkat dan menurunkan, selanjutnya celupkan ke dalam campuran asam-alkohol 1% secara cepat 5-7 celup.
Bilas dalam aquades selama 1 menit, dan bilas kembali dengan aquades selama 15 menit.
Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan lithium karbonat selama 15-30 detik hingga potongan berwarna biru cerah dan kemudian cuci dalam air mengalir selama 15 menit.
Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi 96%, 96%, 100%, dan 100% masing-masing selama 3 menit.
Preparat kemudian direndam dalam xylol selama masing-masing 2 menit.
Selanjutnya dilakukan proses mounting yaitu penutupan preparat dengan cover glass dengan menggunakan permount sebagai perekat.
4.7.7 Prosedur pembacaan preparat
a. Pembacaan jumlah osteoklas dengan cara menghitung jumlah sel yang terlihat pada mikroskop dengan pembesaran 400x
b. Pembacaan jumlah osteoblas dengan cara menghitung jumlah sel yang terlihat pada mikroskop dengan pembesaran 400x
c. Pembacaan densitas tulang dengan cara menghitung jarak antara susunan satu trabekula dengan trabekula lainnya yang terlihat pada mikroskop dengan menggunakan program morfometri pada komputer.
d. Pembacaan preparat dilakukan oleh drh. Ida Bagus Oka Winaya selaku dosen laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Bali dengan hasil terlampir pada lampiran 4.