Prosedur Penelitian

METODE PERCOBAAN

3.3 Prosedur Penelitian

3.3. 1 Pembuatan Media dan Larutan Pereaksi

3.3.1.1 Media Nutrient Agar (NA)

Sebanyak 28 gram serbuk nutrient agar dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121^oC selama 15 menit (Difco Laboratories, 1977).

Sebanyak 13 gram serbuk nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121^oC selama 15 menit (Difco Laboratories, 1997).

3.3.1.3Media Briliant Green Lactose Broth (BGLB)

Sebanyak 40 gram ditimbang serbuk BGLB dilarutkan dalam air suling sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121^oC selama 15 menit (Difco Laboratories,1997).

Penanaman air limbah dengan metode gores : 1. Penanaman langsung dari limbah

Dituangkan 15 ml media nutrient agar ke dalam cawan petri steril kemudian dibiarkan hingga memadat. Disterilkan jarum ose dengan cara membakar pada bunsen hingga memijar, kemudian setelah suhu jarum ose turun dicelupkan jarum ose ke dalam air limbah. Digoreskan jarum ose pada permukaan media yang telah memadat.Diinkubasi pada suhu 35-37^oC selama 24 jam. Diamati pertumbuhan bakteri pada cawan.

2. Penanaman di dalam Media Briliant Green Lactose Broth terlebih dahulu

Disediakan 5 ml BGLB yang telah steril dalam tabung reaksi. Ditambahkan 0,1 ml air limbah ke dalam media tersebut. Kemudian diinkubasi selama 3 jam pada suhu 35-37^oC. Dilakukan penggoresan dari media BGLB seperti cara 1.

3.3.2 Identifikasi Golongan Bakteri Dengan Pengecatan Gram

Disterilkan objek gelas dengan menggunakan alkohol 70% kemudian difiksasi.Ditambahkan 2 tetes akuades steril. Dengan menggunakan jarum ose steril diambil koloni bakteri dan disuspensikan pada akuades steril yang ada di objek gelas,

difiksasi. Ditambahkan 1 tetes gentian violet dan 1 tetes lugol, difiksasi. Dicuci objek gelas dengan menggunakan alkohol 70% hingga tetesan terakhir tidak berwarna, difiksasi. Ditambahkan 1 tetes safranin, dibiarkan selama 15-20 detik. Dicuci objek gelas dengan menggunakan akuades sterilhingga tetesan terakhir tidak berwarna, difiksasi. Ditambahkan 1 tetes imersi oil, diamati dengan mikroskop pada perbesaran 100 kali.

3.3.3 Pembuatan Agar Miring

Kedalam tabung reaksi steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring kira-kira 45^o, kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5^oC.

3.3.4 Perbanyakan Bakteri Pada Agar Miring

Disterilkan jarum ose, kemudian diambil koloni kuning dari permukaan media agar dari cawan sebelumnya. Digoreskan pada permukaan agar miring. Diinkubasi pada suhu 35-37^oC selama 24 jam. Dilakukan hal yang sama dengan bakteri koloni orange dan bakteri koloni krem.

3.3.5 Pembuatan Inokulum Bakteri

Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu disuspensikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan nutrient broth. Kemudian diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25% (Ditjen POM, 1995).

3.3.6 Pengujian COD air limbah dengan menambahkan bakteri yang telah dipisahkan

Diambil air limbah yang telah diukur nilai CODnya. Kemudian disterilkan pada autoklaf pada suhu 121^oC selama 30 menit. Dibuat perbandingan (v/v) antara air limbah dan inokulum bakteri. Kemudian diinkubasi pada suhu 35-37^oC selama 24 jam dan selanjutnya diukur nilai COD air limbah tersebut.

3.3.7 Pembuatan Pereaksi 3.3.7.1 Larutan K2^{Cr2O7 0,25 N}

Sebanyak 12,259 gram kristal K2^Cr2^O7^{yang telah diaktifkan (dikeringkan dalam oven} pada suhu ±105^oC selama 2 jam dan didinginkan di dalam desikator untuk menghilangkan kelembaban) ditimbang dalam botol timbang dan dimasukkan secara kuantitatif dalam labu takar 1000ml, dilarutkan dengan aquadest, lalu diencerkan sampai garis tanda.

3.3.7.2 Larutan Indikator Fenantrolin Fero Sulfat (Feroin)

Sebanyak 1,485 gram kristal 1,10-ortofenantrolin monohidrat dan 0,695 gr FeSO₄.7H₂O ditimbang dalam botol timbang dan dimasukkan secara kuantitatif dalam labu takar 100 ml, dilarutkan dengan aquadest lalu diencerkan sampai garis tanda.

3.3.7.3 Larutan Ferro Ammonium Sulfat 0,1N

Dilarutkan sebanyak 40 gram Fe(NH₄)₂(SO₄).6H₂O dalam aquadest dan ditambahkan 20 ml H₂SO_4(p) lalu didinginkan dan diencerkan dengan aquadest sampai 1L.

Standarisasi Larutan Titran Ferro Ammonium Sulfat (FAS)

Sebanyak 10 ml larutan K2^Cr2^O7^{0,25N dimasukkan kedalam erlenmeyer,} ditambahkan aquadest sebanyak 50 ml, kemudian melalui dinding erlenmeyer ditambahkan secara perlahan 30 ml H2^SO4(P) ^{sambil diaduk dan didinginkan.} Kemudian ditambahkan 2-3 tetes indikator Ferroin ke dalam larutan dan selanjutnya dititrasikan dengan larutan standar Ferro Ammonium Sulfat hingga warna larutan berubah dari hijau kebiru-biruan menjadi coklat kemerahan. Dicatat banyaknya volume standart FAS yang digunakan.

Normalitas FAS = ml K2^Cr2^O7 ^{x N K}2^Cr2^O7 ml FAS yang digunakan

= 10 ml x 0,25 N

= 0,1002 N 24,95

3.3.8 Penentuan Nilai COD dari Larutan blanko

Sebanyak 0,5 gram Hg2^SO4 ^{ditimbang di dalam erlenmeyer 500 ml kemudian dipipet} 10 ml K₂Cr₂O₇, ditambahkan batu didih. Selanjutnya dipipet 25 ml aquadest. Ditambahkan 30 ml H₂SO_4(p) secara perlahan-lahan dan didiamkan sementara. Kemudian larutan direfluks selama ± 2 jam. Larutan didinginkan dan ditambahkan aquadest hingga garis tanda. Rangkaian alat refluks dilepas. Ditambahkan 2-3 tetes indikator Ferroin dan dititrasi dengan larutan standar Ferro Ammonium Sulfat 0,1002 N hingga warna larutan berubah dari hijau-kebiru biruan menjadi coklat kemerahan. Dicatat banyaknya volume larutan standart FAS yang digunakan.

3.3.9 Penentuan Nilai COD dari Larutan sampel

Sebanyak 0,5 gram Hg₂SO₄ ditimbang di dalam erlenmeyer 500 ml kemudian dipipet 10 ml K2^Cr2^O7^{, ditambahkan batu didih. Selanjutnya dipipet 25 ml air limbah.} Ditambahkan 30 ml H2^SO4(p) ^{secara perlahan-lahan dan didiamkan sementara.} Kemudian larutan direfluks selama ± 2 jam. Larutan didinginkan dan ditambahkan aquadest hingga garis tanda. Rangkaian alat refluks dilepas. Ditambahkan 2-3 tetes indikator Ferroin dan dititrasi dengan larutan standar Ferro Ammonium Sulfat 0,1002 N hingga warna larutan berubah dari hijau-kebiru biruan menjadi coklat kemerahan. Dicatat banyaknya volume larutan standart FAS yang digunakan.