METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah 1050 gram daun tumbuhan sambiloto (Andrographis
paniculata (Burm.f.) Ness) yang diperoleh dari areal pertanaman Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara.
3.3.2. Uji Skrining Fitokimia
Dilakukan uji pendahuluan terhadap daun tumbuhan sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f.) Ness) untuk membuktikan adanya senyawa alkaloida yang terdapat di dalamnya. Uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna.
Prosedur :
- Dimasukkan 10 gram daun tumbuhan sambiloto (Andrographis paniculata
(Burm.f.) Ness) yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam
erlenmeyer
- Ditambahkan metanol secukupnya
- Didiamkan selama 1 malam
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan pereaksi Meyer menghasilkan larutan berwarna
kekeruhan
b. Tabung II : dengan pereaksi Wagner menghasilkan endapan berwarna
cokelat
c. Tabung III : dengan pereaksi Bouchardat menghasilkan endapan berwarna
cokelat
d. Tabung IV : dengan pereksi Daragendorf menghasilkan endapan berwarna
3.3.3. Pengadaan Ekstrak Kloroform Daun Tumbuhan Sambiloto
Daun tumbuhan sambiloto yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ditimbang sebanyak 1050 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 7 liter selama ± 48 jam, kemudian disaring dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga terbentuk ekstrak pekat metanol. Ekstrak pekat metanol tersebut dipartisi berulang-ulang dengan menggunakan n-heksan sebanyak 10 kali. Lalu diambil lapisan metanol dan dipekatkan. Kemudian diasamkan dengan menggunakan asam asetat 2% hingga mencapai pH=4 sambil diaduk. Lalu didiamkan selama 1 malam, kemudian
dibasakan dengan NH4OH(p) sampai pH=10 sambil diaduk dan didiamkan selama 1
malam. Lalu diekstraksi partisi dengan menggunakan kloroform sebanyak 3 kali, lapisan kloroform ditampung kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebagai alkaloida total sebanyak 0,537 gram.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis dimaksudkan untuk mencari perbandingan pelarut yang sesuai di dalam pemisahan senyawa dengan meningkatkan kepolarannya dalam kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol (9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9) v/v, sehingga diperoleh perbandingan pelarut kloroform : metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Pelarut yang sesuai didasarkan kepada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur:
Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu campuran pelarut kloroform : metanol dengan campuran pelarut (9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9) v/v. Kemudian ekstrak kloroform ditotolkan pada plat KLT yang sudah diaktifkan. Lalu plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan.
Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difraksinasi dengan pereaksi bouchardat. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan pelarut kloroform : metanol (9:1) v/v yang memberikan tiga noda dengan harga Rf yaitu: 0,875 ; 0,625 ; 0,325.
3.3.5. Isolasi Senyawa Alkaloida dengan Kromatografi Kolom
Dilakukan isolasi senyawa alkaloida terhadap total alkaloida yang telah diperoleh dengan menggunakan kromatografi kolom. Dimana sebagai fase diam yaitu silika gel 60 GF (0,063-0,200 mm) E.Merck.Art.7734 dan fase gerak yaitu pelarut kloroform 100% dengan campuran pelarut kloroform : metanol (90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50 ; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90) v/v.
Prosedur :
Dibersihkan peralatan kromatografi kolom, dibilas dengan metanol, dikeringkan, dan dirangkai. Kemudian silika gel 60 GF (0,063-0,200 mm) E.Merck.Art.7734 sebanyak 20 gram dibuburkan dengan pelarut n-heksana, diaduk sampai homogen dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Lalu dielusi dengan n-heksana 100% hingga bubur silika gel memadat dan homogen. Dimasukkan alkaloida total sebanyak 0,537 gram yang telah dibuburkan dengan silika gel ke dalam kolom kromatografi yang telah diaktifkan. Sampel dibiarkan turun hingga memadat. Kemudian dielusi dengan pelarut kloroform 100% sebanyak 100 ml dan diatur aliran fraksi yang keluar dari kolom kromatografi bergerak secara kontinu dan ditampung tiap fraksi dalam botolfial masing-masing sebanyak 8 ml.
Perlakuan yang sama dilakukan terhadap campuran pelarut antara kloroform : metanol (90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50 ; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90) v/v. Tiap-tiap fraksi yang telah diperoleh dari hasil elusi pelarut kloroform 100% dan variasi pelarut diKLT, lalu digabung fraksi dengan harga Rf yang sama dari perbandingan pelarut kloroform : metanol (90 : 10) v/v, kemudian diuapkan pelarutnya hingga diperoleh kristal.
3.3.6. Analisis Kristal Hasil Isolasi
3.3.6.1. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dimana
fase diam yang digunakan adalah Kieselgel 60 F254 (0,2 mm) E.Merck.Art 554 dan fase
gerak kloroform : metanol 90 : 10 v/v.
Prosedur:
Kristal yang diperoleh dilarutkan dengan metanol, lalu ditotolkan pada plat KLT.
1. Dimasukkan larutan fase gerak kloroform : metanol (90 : 10 v/v) dalam bejana
kromatografi lapis tipis yang telah dijenuhkan. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan ke dalam bejana kromatografi tersebut dan dibiarkan hingga pelarut naik sampai batas atas yang telah ditentukan dalam plat tipis.
2. Dikeluarkan plat dari bejana kromatografi, lalu dikeringkan dan dilihat bercak
noda di bawah lampu UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi bouchardat yang memberikan bercak noda berwarna cokelat yang menunjukkan bahwa senyawa alkaloida positif.
3. Dikeringkan hingga terbentuk kristal. Dari kristal yang terbentuk tersebut
diperoleh 2 warna kristal dan hasil bercak noda dari KLT yang telah dilakukan diperoleh lebih dari satu bercak noda.
4. Dimurnikan dengan metanol sebanyak 3 kali, kemudian diuapkan hingga
terbentuk kristal.
Dilakukan uji kemurnian terhadap kristal yang sudah dimurnikan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dengan cara :
- Dimasukkan larutan fase gerak kloroform : metanol (90 : 10 v/v) dalam bejana
kromatografi lapis tipis yang telah dijenuhkan. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan ke dalam bejana kromatografi tersebut dan dibiarkan hingga pelarut naik sampai batas atas yang telah ditentukan dalam plat tipis.
- Dikeluarkan plat dari bejana kromatografi, lalu dikeringkan dan dilihat bercak noda di bawah lampu UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi bouchardat yang memberikan bercak noda tunggal berwarna cokelat yang menunjukkan bahwa senyawa alkaloida positif.
3.3.6.2. Uji Reaksi Warna terhadap Kristal Hasil Isolasi dengan Pereaksi Alkaloida
Dilarutkan kristal hasil isolasi secukupnya ke dalam botolfial, lalu diteteskan menjadi 4 larutan ke dalam plat tetes.
1. Larutan pertama ditetesi dengan pereaksi Meyer memberikan larutan berwarna
kekeruhan
2. Larutan kedua ditetesi dengan pereaksi Bouchardat memberikan endapan berwarna
cokelat
3. Larutan ketiga ditetesi dengan pereaski Wagner memberikan endapan berwarna
cokelat
4. Larutan ketiga ditetesi dengan pereaksi Dragendorf memberikan endapan berwarna
putih kekuningan
3.3.6.3. Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam peralatan melting point apparatus, diatur temperaturnya, lalu diamati temperatur awal mulai kristal melebur sampai kristal melebur seluruhnya.
3.3.7. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi
3.3.7.1. Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang. (lampiran E)
3.3.7.2. Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton 1H-NMR
Analisis Kristal hasil isolasi dengan alat Spektrometer 1H-NMR dilakukan di Pusat
Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang dengan menggunakan metanol (CD3OD)
3.3. Bagan Tes Uji Pendahuluan (Skrining Fitokimia) terhadap Daun Tumbuhan