METODOLOGI PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan lagundi yang diperoleh dari daerah Hutatinggir Desa Saribudolok kabupaten Simalungun. Daun tumbuhan Lagundi dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan lagundi sebanyak 2000 gram.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Lagundi
Serbuk daun tumbuhan Lagundi diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Skrining fitokimia
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan lagundi, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
Prosedur :
- Dimasukkan ± 10 gram daun tumbuhan Lagundi (V. trifolia L.) yang telah
dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam gelas erlenmeyer
- Ditambahkan metanol ± 100 ml
- Didiamkan
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl3
b. Tabung II : dengan H
5% menghasilkan larutan berwarna hitam
2SO4(p)
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah bata
menghasilkan larutan hitam
d. Tabung IV : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan berwarna hitam
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F254
Prosedur:
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40; 50:50) v/v.
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat (90:10) v/v ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang panjangnya 20 cm yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk
perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80 :20)v/v; (70:30)v/v; 60:40 ; dan 50:50)v/v.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun tumbuhan lagundi terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak
n-heksana : etil asetat (60:40)v/v (LAMPIRAN C).
3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Tumbuhan Lagundi
(V. trifolia L.)
Serbuk daun tumbuhan lagundi ditimbang sebanyak 2000 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 12 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 3 hari. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 10 gram.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100%, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10) v/v dan (60:40) v/v.
Prosedur :
Dirangkai alat kolom kromatografi. Kemudian kolom kromatografi dibilas dengan metanol untuk membersihkan kolom kromatografi.Lalu dimasukkan pelarut kedalam kolom kromatografi denganmenggunakan n-hekasana 100%. Kemudian dimasukkan serbuk silika gel kedalam kolom kromatografi. Didiamkan selama 1 malam agar silika gel padat dan
homogen. Dimasukkan 10 gram ekstrak pekat metanol daun tumbuhan Lagundi kedalam kolom kromatografi yang telah berisi silika gel,kemudian ditampung pelarut n-heksana 100% yang ada didalam kolom kromatografi. Lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (90:10) v/v secara berlahan-lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom kromatografi sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (60:40)v/v. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml, lalu di KLT dan
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl3 5%. Kemudian diuapkan
sampai terbentuk pasta.
3.3.5 Pemurnian (Rekristalisasi)
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi harus dimurnikan. Prosedur :
Pasta yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat, diaduk hingga semua pasta larut sempurna. Kemudian ditambahkan n–heksana secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas, lalu diuapkan sisa pelarut dari pasta hingga diperoleh pasta yang benar – benar bebas dari pelarut.
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat (60:40) v/v.
Prosedur :
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi
dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5% dalam metanol menghasilkan bercak berwarna
3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut (Lampiran E).
3.3.7.2. Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1
Analisis dengan alat Spektrometer
H-NMR)
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan aseton
sebagai pelarut (Lampiran H).
3.3.7.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian