BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Isolasi Kapang Endofit Kentang
Isolasi kapang endofit kentang diawali dengan sterilisasi permukaan yang bertujuan untuk menghilangkan mikrob kontaminan dari permukaan akar, batang dan umbi (tuber) kentang. Sterilisasi dilakukan dengan merendam potongan akar, batang dan umbi kentang (panjang potongan ± 5 cm) pada sodium hipoklorit 2% selama 2 menit. Masing-masing Potongan tersebut dibilas berturut-turut dengan akuades steril sebanyak satu kali, alkohol 70% sebanyak 3-5 kali dan dilanjutkan dengan akuades steril sebanyak 5 kali untuk membersihkan sisa-sisa desinfektan. Selanjutnya, potongan organ kentang tersebut dibagi menjadi bagian yang lebih kecil (± 1cm) dan dibelah secara aseptis menjadi dua bagian secara horizontal untuk memaparkan jaringan bagian dalam potongan tersebut (Kim et al, 2013).
Potongan-potongan kentang yang telah disterilkan ditransfer secara aseptis pada medium Malt Extract Agar dan diinkubasi gelap (tanpa paparan cahaya) pada suhu 30°C selama 3 hari. Koloni kapang dengan morfologi berbeda dipisahkan untuk pemurnian dengan menginokulasikan satu jarum inokulum spora pada medium PDA dan diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30°C dengan tiga kali pengulangan. Masing-masing kultur murni kapang endofit kentang hasil pemurnian terakhir diremajakan pada medium PDA miring sebelum diuji lebih lanjut.
13 3.4.2 Uji Aktivitas L-asparaginase Secara Semikuantitatif
Uji aktivitas L-asparaginase secara semikuantitatif dilakukan dengan menginokulasikan satu jarum inokulum spora kapang endofit pada medium M9 modified yang mengandung indikator phenol red dan diinkubasi padasuhu 30˚C
selama 3×24 jam. Diameter koloni dan zona pink masing-masing isolat diukur untuk menentukan indeks aktivitas enzim dengan persamaan berikut:
Isolat dengan indeks aktivitas terbaik diidentifikasi secara mikroskopis dengan metode slide culture (identifikasi mikroskopis) dan diremajakan kembali pada medium PDA miring untuk uji selanjutnya.
3.4.3 Produksi Enzim L-asparaginase Dengan Solid State Fermentation a. Pembuatan Inokulum
Pembuatan inokulum ditentukan diawali dengan pembuatan pola pertumbuhan kapang endofit berdasarkan penghitungan kepadatan spora sampai didapatkan jumlah spora 108 sel/ml. Mitchell et al, (2000) menyatakan bahwa Umumnya, teknik fermentasi substrat padat membutuhkan spora dengan kepadatan optimum yakni pada range 104 hingga 108 Spora/mL. Namun, kepadatan 108 spora/mL adalah kepadatan spora yang paling banyak digunakan pada fermetasi substrat padat, karena kepadatan spora (inokulum) yang terlalu tinggi (>108 Spora/mL) akan menyebabkan terhambatnya produksi enzim terhambat karena terlalu banyak biomassa mikroba yang tumbuh hingga mereduksi jumlah nutrisi yang diperlukan untuk memproduksi enzim. Sedangkan jika densitas spora terlalu rendah (< 104 spora/ mL), biomassa kapang untuk fermentasi tidak mencukupi dan kemungkinan terjadinya kontaminasi meningkat (Rambault, 1980).
Penghitungan kepadatan spora kapang endofit dibuat dengan mengkulturkan spora pada 7 medium PDA miring, kemudian diinkubasi pada inkubator suhu 30°C.
14 Kultur PDA miring diamati kepadatan sporanya setiap hari berturut-turut selama satu minggu. Pengamatan dilakukan dengan menambahkan 9 mL akuades (dengan Tween 80 0.2%. sebagai agen dispersi) steril pada tiap tabung kultur (Higo et al., 2011). Spora dikerik menggunakan jarum inokulum hingga merata. Suspensi spora yang didapat dipindahkan secara aseptis pada tabung lain. Sebelum pengamatan, suspensi spora dihomogenkan dengan vortex. 20 µL suspensi spora diteteskan pada bidang hitung haemocytometer Neubauer (Gambar 3.1) dan dihitung dengan bantuan mikroskop. spora yang dihitung adalah spora yang ada pada kotak sedang haemocytometer. Penghitungan dilakukan sebanyak lima kali ulangan.
Gambar 3.1 Bidang hitung penghitungan spora pada haemocytometer
Selanjutnya, Jumlah spora/ml sampel ditentukan dengan persamaan berikut (BBPPTP Surabaya, 2014):
Keterangan:
S : Jumlah spora/ml
n : Rerata spora pada bidang hitung 1, 2, 3, 4, dan 5 L : Luas bidang hitung kotak ( )
t : kedalaman bidang hitung (0.1 mm) d : Faktor pengenceran
15 b. Produksi Enzim L-asparaginase
Produksi L-asparaginase dilakukan dengan menginokulasikan 0.5 mL suspensi spora dengan kerapatan 108 spora/mL pada medium Soybean Meal Medium yang terdiri dari 2.25 g tepung kedelai dan 2.25 mL larutan Mineral Mandel dengan dua kali ulangan (pada. Pemilihan Soybean (kedelai; Soja max) adalah karena medium tersebut adalah medium yang umum digunakan dalam solid state fermentation selain itu, kedelai memiliki kandungan nutrisi yang lengkap dan asam amino yang tinggi (Singhania et al., 2009). Masing-masing kultur produksi diinkubasi pada inkubator bersuhu 30°C selama 24, 48 hingga 144 jam.
Ekstraksi enzim ekstrak kasar L-asparaginase dilakukan dengan menambahkan 22.5 mL buffer Tris HCl 50 mM dengan pH 8.5 dan dihomogenkan dengan di shake pada rotary shaker 150 rpm selama 1 jam (Gosh et al. 2013). Penggunaan buffer Tris HCl dengan pH 8.5 berdasarkan pernyataan Sinha et al. (2013) bahwa pada umumnya L-asparaginase memiliki stabilitas terbaik pada pH 8 hingga 8.5.
Suspensi kultur produksi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm dan suhu 4°C selama 15 menit (Ebrahiminezhad et al, 2011). Supernatan yang merupakan enzim ekstrak kasar ditampung dalam botol kaca secara aseptis untuk penyimpanan dan uji lanjutan. Seluruh prosedur ekstraksi dilakukan on ice untuk mencegah kerusakan protein akibat fluktuasi suhu.
3.4.4 Uji aktivitas Enzim Ekstrak Kasar L-asparaginase a. Pembuatan Kurva Standart Ammonia
Pembuatan standar amonium dilakukan dengan mereaksikan 100µL
ammonium sulfat konsentrasi 5 M, 10 M, 15 M, 20 M, 25 M, 30 M, dan 35 M dengan reagen Nessler sebanyak 200 µL serta 3.7 mL akuades. Campuran
16 dilakukan dengan panjang gelombang 450 nm. Sebagai blanko, digunakan 100 µL akuades (Kushwaha et al, 2012).
Selanjutnya dibuat kurva standar amonium sulfat. Kurva standar tersebut menunjukkan hubungan antara absorbansi pada =450 nm dengan konsentrasi
ammonium sulfat yang digunakan.
b. Uji Aktivitas L-Asparaginase
Uji kuantitatif aktivitas L-asparaginase dilakukan dengan metode Nesslerisasi amonia yang telah dimodifikasi oleh Singh et al. (2013). Untuk perlakuan test, Crude enzyme sebanyak 500 µL direaksikan dengan 500 µL L-asparagin (0.04 M) dan 500 µL buffer Tris HCl 50 mM (pH 8.5), campuran tersebut diinkubasi pada suhu 30°C selama 30 menit.
Reaksi dihentikan dengan menambahkan 500 µL asam trikloroasetat (TCA) 1.5 M dan didiamkan selama 5 menit, dilanjutkan dengan sentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 8000 rpm suhu 4°C untuk memisahkan campuran dari presipitat. Sedangkan pada perlakuan kontrol, L-asparagin 0.04 M direaksikan dengan TCA selama 5 menit, kemudian ditambahkan ekstrak kasar L-asparaginase, dan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepattan 8000 rpm suhu suhu 4°C untuk memisahkan presipitat.
Sebanyak 100 µL supernatan hasil sentrifugasi direaksikan berturut-turut dengan 200 µL reagen Nessler dan 3700 µL akuades steril. Campuran tersebut dihomogenkan dan direaksikan selama 20 menit. Kadar amonia test dan kontrol diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm. Aktivitas enzim (UI) dinyatakan sebagai jumlah amonia yang dihasilkan (mmol) oleh 1 mL enzim yang digunakan. UI enzim L-asparaginase ditentukan dengan persamaan berikut:nnnnnnnnnnnnn digunakan yang enzim volume menit t mol dilepas yang ammonia Jumlah mL U inkubasi ) ( ) ( /
17 3.4.5 Karakterisasi Enzim L-asparaginase (Singh et al, 2013)
a. Pengaruh Suhu Pada Aktivitas Enzim L-asparaginase
Pengujian suhu dilakukan pada crude enzyme yang diproduksi berdasarkan waktu inkubasi optimum. Metode yang digunakan sama dengan langkah uji aktivitas enzim (Langkah 3.2.3). Namun, pada langkah enzim ekstrak kasar dan substrat direaksikan pada suhu 20, 30, 40, 50, 60, 70 dan 80°C.
b. Pengaruh pH Pada Aktivitas Enzim L-asparaginase
Penentuan pH optimum dari enzim ekstrak kasar L-asparaginase ditentukan dengan mereaksikan enzim ekstrak kasar dan substrat pada buffer reaksi dengan berbagai tingkat keasaman. Tingkat keasaman dan jenis buffer reaksi yang digunakan adalah: buffer asam sitrat (pH 4-5), buffer fosfat (pH 6-7), buffer Tris HCl (pH 8) dan glisin-NAOH (pH 9-11.). uji aktivitas pada tingkat keasaman tersebut dilakukan dengan metode yang sama dengan uji aktivitas enzim L-asparaginase secara kualitatif.
c. Pengaruh Logam Pada Aktivitas Enzim L-asparaginase
Pengujian logam dilakukan dengan metode yang sama dengan langkah uji aktivitas enzim. Namun, pada langkah ini, digunakan pH dan suhu inkubasi optimum dari dua uji karakterisasi sebelumnya. Buffer yang digunakan hanya setengah dari total volume buffer sebelumnya (0.25 ml ) dan ditambahkan larutan ion logam (0.25 ml) dengan konsentrasi 1 µM. Ion logam yang digunakan antara lain Mg2+, Fe2+, Ca2+, Zn2+, Al2+,Mn2+.
18