METODOLOGI PENELITIAN
3.4. Prosedur Penelitian
3.4.1. Penyediaan Hewan Penelitian
Penelitian ini menggunakan tikus jantan (Rattus norvegicus L.) galur wistar yang berumur 8-12 minggu dengan berat badan 200-250 g, yang diperoleh dari Balai Veteriner Sumatera Utara, Medan sebanyak 25 ekor dan dipelihara di Balai Pemeliharaan Tikus di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara, Medan. Tikus diberi makan dan minum setiap hari secara teratur. Kandang terbuat dari bahan plastik (ukuran 50x30x15 cm), yang ditutupi dengan kawat kasa. Kandang diberi alas sekam dan diganti sebanyak dua kali dalam seminggu (Smith & Mangkoewidjojo, 1988). Pemanfaatan hewan dalam penelitian dilakukan sesuai dengan kode etik yang berlaku (KNEPK, 2006; Ridwan, 2013).
3.4.2. Pembuatan Kotak Perlakuan Sampel
Kotak perlakuan sampel terbuat dari gabus yang dilapisi dengan busa serta triplek polywood kedap suara yang telah dirangkai dengan speaker, multy player 3
dengan file yang berisi rekaman suara bising dengan frekwensi 1 hingga amplifier yang akan mengatur intensi
dibutuhkan. Dan terdapat pula s
intensitas bising pada kotak perlakuan, perlakuan bising.
Gambar 3.1. Kotak Perlakuan Sampel dihubungkan dengan tikus perlakuan
3.4.3. Pembuatan Larutan Kulit Manggis ( Ekstrak kulit manggis
penelitian ini adalah ekstrak kulit manggis kapsul dengan merek dagang G.
pencegahan penyakit pada
dikonversikan dengan tabel konversi (Laurence & Bacharach, 1964). Sehingga ditemukan dosis yang sesuai untuk tikus.
Perhitungan dosis:
1 kapsul = 400 mg, 400 mg x 3 kapsul/hari= 1200 mg
Nilai konversi x 1200 mg= 0,018 x 1200 mg= 21,6 mg. Pemberian ekstrak kulit manggis (Garcinia mangostana
21,6 mg di dalam 0,5 ml a
3.4.4. Pemeriksaan Keadaan Normal
Tikus yang akan diberi perlakuan terlebih dahulu diperiksa keadaan normal telinganya dengan menggunakan alat OAE
terlebih dahulu dipingsankan dengan memasukkan tikus ke dalam tabung berisi eter 99,5%. Setelah tikus pingsan, dilakukan pemeriksaan telinga dengan alat OAE. Pada pemeriksaan emisi otoakustik stimulus bunyi tertentu diberikan
a
yang berisi rekaman suara bising dengan frekwensi 1 hingga
akan mengatur intensitas bising sesuai dengan volume yang Dan terdapat pula sound level meter digunakan untuk mengukur intensitas bising pada kotak perlakuan, serta timer sebagai pengukur waktu
1. Kotak Perlakuan Sampel. Keterangan: (a) pintu, (b
dihubungkan dengan mp3 dan amplifier, (c) kaca untuk mengamati tikus perlakuan, (d) kandang plastik tempat tikus perlakuan
. Pembuatan Larutan Kulit Manggis (Garcinia mangostana
Ekstrak kulit manggis (Garcinia mangostana L.) yang digunakan dalam ini adalah ekstrak kulit manggis yang telah dikemas dalam bentuk dengan merek dagang G. Konsumsi ekstrak kulit manggis
pencegahan penyakit pada manusia adalah sebanyak 1 kapsul, 3 kali/hari. Dosis dengan tabel konversi (Laurence & Bacharach, 1964). Sehingga sis yang sesuai untuk tikus.
1 kapsul = 400 mg, 400 mg x 3 kapsul/hari= 1200 mg
Nilai konversi x 1200 mg= 0,018 x 1200 mg= 21,6 mg. Pemberian ekstrak kulit Garcinia mangostana L.) pada tikus dilakukan satu kali/ hari sebanyak 21,6 mg di dalam 0,5 ml akuades.
. Pemeriksaan Keadaan Normal
Tikus yang akan diberi perlakuan terlebih dahulu diperiksa keadaan dengan menggunakan alat OAE (Otoacoustic Emisson
terlebih dahulu dipingsankan dengan memasukkan tikus ke dalam tabung berisi eter 99,5%. Setelah tikus pingsan, dilakukan pemeriksaan telinga dengan alat Pada pemeriksaan emisi otoakustik stimulus bunyi tertentu diberikan
b c d
yang berisi rekaman suara bising dengan frekwensi 1 hingga 10 kHz, s bising sesuai dengan volume yang digunakan untuk mengukur sebagai pengukur waktu
b) speaker yang ) kaca untuk mengamati kandang plastik tempat tikus perlakuan.
Garcinia mangostana L.)
digunakan dalam yang telah dikemas dalam bentuk ekstrak kulit manggis untuk dosis 3 kali/hari. Dosis dengan tabel konversi (Laurence & Bacharach, 1964). Sehingga
Nilai konversi x 1200 mg= 0,018 x 1200 mg= 21,6 mg. Pemberian ekstrak kulit L.) pada tikus dilakukan satu kali/ hari sebanyak
Tikus yang akan diberi perlakuan terlebih dahulu diperiksa keadaan Otoacoustic Emisson). Tikus terlebih dahulu dipingsankan dengan memasukkan tikus ke dalam tabung berisi eter 99,5%. Setelah tikus pingsan, dilakukan pemeriksaan telinga dengan alat Pada pemeriksaan emisi otoakustik stimulus bunyi tertentu diberikan
b c d
melalui loudspeaker
bagian luarnya dilapisi karet lunak ( mendeteksi emisi otoakustik
diproses (Kemp, 2002). Hasil ak normal berupa pass dan
dapat dijadikan acuan untuk me dilakukan setiap harinya
untuk melihat ada atau tidaknya kerusakan yang terjadi.
Gambar 3.2. Alat OAE 3.4.5. Perlakuan Hewan Percobaan
Hewan percobaan diberi perlakuan sesuai dengan pemb hewan percobaan. Hewan yang diberi perlakuan
sebanyak 0,5 ml tiap ekor dicekok dengan menggunakan jarum yang akan diberi perlakuan
yang terbuat dari gabus dilapisi dengan busa serta triplek yang telah dirangkai dengan
dan timer. Menurut Rahayu (2010), terdapat beberapa zona intensitas berbeda, berdasarkan hal tersebut k
perlakuan kebisingan dengan intensitas yang berbeda (25
100 dB) dalam 8 jam setiap hari selama 8 hari. Berat badan hewan percobaan ditimbang setiap 2 hari sekali
3.4.6. Pengambilan Organ untuk Pengamatan
Setelah perlakuan terhadap hewan percobaan selesai, maka dilakukan pembedahan dan pengambilan organ hewan percobaan untuk pengamatan yaitu:
loudspeaker mini yang terletak dalam sumbat telinga (insert probe
bagian luarnya dilapisi karet lunak (probe tip). Mikrofon digunakan untuk mendeteksi emisi otoakustik, kemudian diubah menjadi elektrik agar mudah diproses (Kemp, 2002). Hasil akan muncul pada alat OAE dengan keadaaan
dan refer untuk keadaan telinga yang terganggu
dijadikan acuan untuk memulai percobaan, dan pemeriksaan akan terus dilakukan setiap harinya seiring dengan perlakuan penelitian yang berlangsung
ada atau tidaknya kerusakan yang terjadi.
Gambar 3.2. Alat OAE (Otoacoustic Emisson) Perlakuan Hewan Percobaan
Hewan percobaan diberi perlakuan sesuai dengan pemb
Hewan yang diberi perlakuan Garcinia mangostana sebanyak 0,5 ml tiap ekor dicekok dengan menggunakan jarum gavage
yang akan diberi perlakuan kebisingan dimasukkan ke dalam kotak perlakuan yang terbuat dari gabus dilapisi dengan busa serta triplek polywood
yang telah dirangkai dengan speaker, multy player 3, amplifier, sound level meter Menurut Rahayu (2010), terdapat beberapa zona kebisingan dengan intensitas berbeda, berdasarkan hal tersebut kelompok hewan percobaan diberi perlakuan kebisingan dengan intensitas yang berbeda (25-50 dB, 55
100 dB) dalam 8 jam setiap hari selama 8 hari. Berat badan hewan percobaan setiap 2 hari sekali.
Organ untuk Pengamatan
Setelah perlakuan terhadap hewan percobaan selesai, maka dilakukan pembedahan dan pengambilan organ hewan percobaan untuk pengamatan yaitu:
18 insert probe) yang ). Mikrofon digunakan untuk kemudian diubah menjadi elektrik agar mudah dengan keadaaan untuk keadaan telinga yang terganggu. Hasil normal percobaan, dan pemeriksaan akan terus seiring dengan perlakuan penelitian yang berlangsung
Hewan percobaan diberi perlakuan sesuai dengan pembagian kelompok cinia mangostana L. gavage dan hewan dimasukkan ke dalam kotak perlakuan polywood kedap suara sound level meter, kebisingan dengan hewan percobaan diberi 50 dB, 55-80 dB, 85-100 dB) dalam 8 jam setiap hari selama 8 hari. Berat badan hewan percobaan
Setelah perlakuan terhadap hewan percobaan selesai, maka dilakukan pembedahan dan pengambilan organ hewan percobaan untuk pengamatan yaitu:
a. Dilakukan anestesi terhadap tikus dengan memasukkannya ke dalam tabung yang berisi eter 99,5% sehingga tikus pingsan.
b. Dilakukan pembedahan pada tiap-tiap kelompok perlakuan.
c. Diambil organ lambung hewan percobaan diamati morfologi dan warnanya, difoto dengan camera digital di atas kertas milimeter, dikeluarkan isinya kemudian dimasukkan dalam sampel cup yang berisi larutan buffer formalin 10% untuk pembuatan sediaan histopatologi.
3.4.7. Pembuatan Preparat Histologi Lambung dengan Metode Parafin Pembuatan preparat yang dilakukan dengan metode parafin (Suntoro, 1983) dengan modifikasi sebagai berikut:
a. Fiksasi
Setelah organ lambung tikus diambil, organ dicuci dengan larutan NaCl 0,9% kemudian difiksasi selama 1 malam dengan larutan buffer formalin 10%.
b. Washing (Pencucian)
Setelah difiksasi, organ dicuci dengan alkohol 70% minimal 7 kali pengulangan dan direndam selama 1 malam.
c. Dehidrasi
Dehidrasi dilakukan dengan merendam organ dengan alkohol 70%, 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut selama 1 jam.
d. Clearing (Penjernihan)
Setelah dehidrasi dilakukan clearing dengan merendam organ ke dalam perbandingan alkohol : xylol yaitu: 3:1, 1:1 dan 1:3 selama masing-masing 1 jam serta merendam organ ke dalam xylol selama 1 malam.
e. Infiltrasi
Organ direndam dalam xylol yang berada di dalam oven pada suhu 560C selama 1 jam. Kemudian direndam ke dalam parafin murni I, II, III masing-masing selama 1 jam pada suhu 560C.
f. Embedding (Penanaman)
Organ dimasukkan dalam kotak cetakan. Setelah itu, dituang parafin yang telah cair ke dalam kotak tersebut, dan diberi label. Dibiarkan sampai dingin
20 sehingga membentuk blok parafin. Kemudian dilakukan penempelan blok-blok parafin pada holder yang terbuat dari kayu yang berbentuk persegi. g. Cutting (Pemotongan)
Blok-blok parafin yang telah ditempel pada holder dipotong dengan menggunakan mikrotom sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6 µm.
h. Attaching (Penempelan)
Attaching dilakukan dengan menempelkan pita parafin yang telah dipotong dengan mikrotom pada object glass, yang sebelumnya pita parafin dicelupkan pada air dingin dan air hangat.
i. Pewarnaan
Pewarnaan sediaan dan lambung dengan Hematoxylin Eosin adalah sebagai berikut:
- Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan objek pada xylol sampai parafin habis kira-kira selama ± 15 menit sebanyak 2-3 kali. - Dealkoholisasi, dilakukan secara bertingkat dimulai dari konsentrasi
alkohol absolut, 96%, 80%, 70%, 50%, 30% dan akuades.
- Pewarnaan, dilakukan dengan cara object glass dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxylin selama 3-5 menit, dibilas dengan dengan air mengalir. Selanjutnya dicelupkan dalam alkohol 30%, 50%, 70%, lalu dicelupkan dalam larutan pewarna Eosin 0,5% selama 1-3 menit, kemudian dicelupkan berturut-turut ke dalam alkohol 70%, 80%, 96%, alkohol absolut dan ke dalam xylol.
j. Mounting
Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Diberi label dan diamati di bawah mikroskop.
