TINJAUAN PUSTAKA
3.3. PROSEDUR PENELITIAN 1. Pembuatan Larutan Pereaksi
3.3.1.1 Larutan Induk Standar Tirosin 1000 mg/L
Ditimbang 1 g tirosin dan ditambahkan HCl 1 N sedikit demi sedikit hingga larut kemudian dimasukkan kedalam labu takar 1000 ml dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diperoleh larutan induk standar tirosin 1000 mg/L.
3.3.1.2. Larutan Standar Tirosin 100 mg/L
Dipipet 25 ml larutan induk standar tirosin 1000 mg/L dan dimasukkan kedalam labu takar 250 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diperoleh larutan standar tirosin 100 mg/L.
3.3.1.3. Larutan Seri Standar Tirosin
Dibuat konsentrasi larutan seri standar tirosin bervariasi 10;20;30;40;50;60;70;80;90 mg/L. Masing-masing dipipet sebanyak 2 ; 4 ; 6 ; 8 ; 10 ; 12 ; 14 ; 16 ; 18 ml larutan standar 100 mg/L dan dimasukkan kedalam labu takar 20 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. 3.3.1.4. Larutan Buffer Phosfat
Larutan A: Larutan NaH2PO4.H2O ( 2,76 g dalam 100 ml akuades ) Larutan B: Larutan Na2HPO4( 2,84 g dalam 100 ml akuades )
X ml Larutan A + Y ml Larutan B, dimasukkan kedalam labu takar 20 ml dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.
pH X(ml) Y(ml) 6 8,77 1,23 6,5 6,85 3,15 7 3,9 6,1 7,5 1,6 8,4 8 0,53 9,47
3.3.1.5. Larutan Alkohol 92%
Dimasukkan 95,8 ml alkohol 96% dalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda (Warisno,2003)
3.3.1.6. Larutan CH3COOH 1%
Dilarutkan 1 ml CH3COOH glasial dalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.
3.3.1.7. Larutan NaOH 0,2N
Dilarutkan 4 g NaOHdengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml dan diencerkan sampai garis tanda.
3.3.1.8. Larutan HCl 1 N
Dilarutkan 8,33 ml HCl(p) dalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.
3.3.1.9. Larutan Kasein 1%
Dilarutkan 1 g kasein dengan buffer phosphat pH 7 kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai garis tanda.
3.3.1.10. Larutan Asam Trikloroasetat 30%
Dilarutkan 30 g asam trikloroasetat dengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai garis tanda.
3.3.1.11. Larutan Enzim Papain 1%
Dilarutkan 1 g enzim papain dengan buffer phosfat pH 7 kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai garis tanda.
3.3.1.12. Pereaksi Biuret
Dilarutkan 3 g CuSO4.5H2O dan 9 g Na-K-Tartrat dengan NaOH 0,2 N kemudian dimasukkan kedalam labu takar 500 mL dan diencerkan sampai garis tanda, kemudian ditambahkan 5 g KI dan dimasukkan kedalam labu takar 1000 mL dan diencerkan dengan NaOH 0,2 N sampai garis tanda.
3.3.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi
3.3.2.1. Pembuatan Kurva Kalibrasi Tirosin
3.3.2.1.1. Penentuan maks Larutan Standar Tirosin
Diambil larutan seri standar tirosin 50 mg/L dan diukur maksdengan melihat spectrum puncak serapan maksimum tirosin kemudian dilakukan pemeriksaan peakspectrumtirosin dan diperoleh makspada absorbansi maksimum.
3.3.2.1.2 Penentuan Kurva Kalibrasi Larutan Standar Tirosin
Dinolkan absorbansinya dengan blanko akuades. Masing-masing larutan seri standar tirosin 0;10;20;30;40;50;60;70;80;90 mg/L diukur absorbansinya pada maks 275 nm kemudian diplotkan konsentrasi dan absorbansi larutan seri standar
3.3.2.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi Bovin Serum Albumin (BSA) Metode Biuret 3.3.2.2.1. Penentuan maks Larutan BSA
Diambil salah satu konsentrasi larutan standar BSA dan diukur maksdengan melihat spectrum puncak serapan maksimum BSA kemudian dilakukan pemeriksaan peakspectrumBSA dan diperoleh makspada absorbansi maksimum.
3.3.2.2.2. Penentuan Kurva Kalibrasi Larutan BSA
Dinolkan absorbansinya dengan blanko akuades. Dipipet masing-masing 0;0,1;0,2;0,4;0,6;0,8mL larutan standar BSA dan ditambahkan masing-masing akuades hingga volume total masing-masing menjadi 4 ml kemudian ditambahkan masing-masing 6 ml pereaksi biuret, diukur absorbansinya pada maks 549 nm kemudian diplotkan konsentrasi dan absorbansi larutan seri standar.
3.3.3. Preparasi Sampel Getah Pepaya (Carica papayaL)
Digores buah pepaya muda dengan menggunakan bambu runcing, dan ditampung getah pepaya pada gelas Beaker.
3.3.4. Isolasi Crude Enzim Papain dari Getah Pepaya (Carica papayaL) dengan metode Balls dan Lineweaver
Sebanyak 7 ml getah pepaya ( Carica papaya L ) dimasukkan kedalam gelas Beaker 250 mL. Kemudian ditambahkan alkohol 92% sebanyak lima kali volume getah pepaya dan disimpan ditempat yang dingin, kemudian disaring. Residunya dikeringkan didalam oven vakum pada suhu 40oC(Warisno,2003).
3.3.5. Penentuan Kadar Protein Enzim Papain Metode Biuret
Dipipet 1 mL larutan papain 1% dan dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan akuades hingga volume total adalah 4 ml, ditambahkan 6 ml Pereaksi Biuret dan didiamkan selama 6 menit pada suhu kamar, dan diukur absorbansinya pada maks549 nm.
3.3.6. Pengujian Aktivitas Crude Enzim Papain metode Murachi 3.3.6.1. Pengujian Suhu Optimum Crude Enzim Papain
Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 6 buah gelas beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu 40,45,50,55,60,65,70oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu yang sama selama 20 menit dan disaring.Kemudian diukur absorbansi masing-masing filtrat pada maks 275 nm (Sebayang,2006)
3.3.6.2. Pengujian pH Optimum Crude Enzim Papain
Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 5 buah gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing-masing 16 mL buffer phosfat dengan variasi pH 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ;8 untuk masing-masing gelas Beaker dan diinkubasi pada suhu 55oC selama 20
menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 55oC selama 20 menit dan disaring. Kemudiandiukur absorbansi masing-masing filtrat pada maks275 nm.
3.3.6.3. Pengujian Aktivitas Crude Enzim Papain
Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan dengan 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing-masing 16 mL buffer phosfat pH 7 kemudian diinkubasi pada suhu 55oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 55oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian diukur absorbansi filtrat pada maks275 nm.
3.3.7. MikroenkapsulasiCrude Enzim Papain
Disediakan 2 gelas Beaker, ke dalam gelas Beaker I dimasukkan 0,6 g Na alginat dan dilarutkan dengan 30 mL akuades, kemudiandiaduk selama 15 menit kemudian ditambahkan 10 ml larutan enzim papain 1%. Ke dalam gelas Beaker II dimasukkan sebanyak 0,2 g kitosan yang dilarutkan dengan 10 mL CH3COOH 1% dan diaduk kemudian ditambahkan 30 ml larutan CaCl2 2%. Diteteskan larutan Na Alginat ke dalam larutan kitosan dan disaring kemudian mikrokapsul yang terbentuk dicuci dengan akuades.Larutan hasil pencucian diuji kadar protein dengan metode Biuret (modifikasi prosedur dari Hwang et al.,1985)
3.3.8. Penentuan Kadar Enzim Papain Yang Tidak Terenkapsulasi
Dipipet 1 mL larutan hasil pencucian mikrokapsul dan dimasukkan kedalam tabung reaksikemudian ditambahkan akuades hingga volume total adalah 4 ml, dan ditambahkan 6 ml Pereaksi Biuret kemudian didiamkan selama 6 menit pada suhu kamar, dan diukur absorbansi pada maks549 nm.
3.3.9. Pengujian Aktivitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain
3.3.9.1. Pengujian Suhu Optimum Mikrokapsul Crude Enzim Papain
Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 6 buah gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan masing 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi
masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu 40,45,50,55,60,65,70oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali masing-masing gelas Beaker dengan variasi suhu yang sama selama 20 menit dan disaring.Kemudian diukur absorbansi masing-masing filtrat pada maks275 nm 3.3.9.2. Pengujian pH Optimum Mikrokapsul Crude Enzim Papain
Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 5 buah gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan masing-masing 16 mL buffer phosfat dengan variasi pH 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ;8 untuk masing-masing gelas Beaker dan diinkubasi pada suhu 60oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian diukur absorbansi masing-masing filtrat pada maks275 nm.
3.3.9.3 Pengujian Aktivitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain
Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 60oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian diukur absorbansi filtrat pada maks275 nm.
3.3.10. Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain
3.3.10.1. Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain Pada Suhu 25oC Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 60oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian diukur absorbansi filtrat pada maks275 nm. Kemudian dipisahkan mikrokapsul dari endapan protein dan dicuci dengan akuades.Mikrokapsul tersebut disimpan pada temperatur 25oC untuk digunakan kembali padapengujian pemakaian berulang ke 2,3,4,5,6,7 dan 8.
3.3.10.2.Pengujian Stabilitas Mikrokapsul Crude Enzim Papain Pada Suhu 10oC Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas Beaker 100 mL dan ditambahkan 4,46 g mikrokapsul dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 60oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian diukur absorbansi filtrat pada maks275 nm. Kemudian dipisahkan mikrokapsul dari endapan protein dan dicuci dengan akuades.Mikrokapsul tersebut disimpan dalam temperatur 10oC untuk digunakan kembali padapengujian pemakaian berulang ke 2,3,4,5,6,7 dan 8.