BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.7 Proses Pengambilan dan Pengolahan Data
3.7.1 Proses Pembuatan Ekstrak Jahe Merah dengan Etanol 96%
Menggunakan Metode Maserasi
Jahe yang dipakai adalah jahe yang segar. Bahan baku jahe merah sebanyak 2000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dan dikupas kulitnya.
Selanjutnya jahe merah dikeringkan di oven selama 24 jam.
Jahe merah yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia. Buat ekstrak dari serbuk kering simplisia dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Gunakan pelarut yang dapat menyaring sebagian besar metabolit sekunder yang terkandung dalam serbuk simplisia seperti etanol 96%.
Masukkan satu bagian serbuk kering simplisia ke dalam maserator, tambahkan 10 bagian pelarut. Rendam selama 6 jam pertama sambil sekali-sekali diaduk, kemudian diamkan selama 18 jam. Pisahkan maserat dengan cara sentrifugasi,
dekantasi atau filtrasi. Ulangi proses penyaringan sekurang-kurangnya satu kali dengan jenis pelarut yang sama dan jumlah volume pelarut sebanyak setengah kali jumlah volume pelarut pada penyaringan pertama.
Kumpulkan semua maserat, kemudian diuapkan dengan penguap vakum atau penguap tekanan rendah hingga diperoleh ekstrak kental yaitu konsentrasi 100%.
3.7.2 Metode Pengenceran Ekstrak Jahe Merah dengan Pelarut Etanol 96%
1. Pembuatan Larutan Konsentrasi 50%
Sebanyak 1 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 2 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
2. Pembuatan Larutan Konsentrasi 25%
Sebanyak 0,5 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 2 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
3. Pembuatan Larutan Konsentrasi 12,5%
Sebanyak 0,25 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 2 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
4. Pembuatan Larutan Konsentrasi 6,25%
Sebanyak 0,125 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 2 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
5. Pembuatan Larutan Konsentrasi 3,125%
Sebanyak 0,0625 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 2 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
3.7.3 Proses Pembuatan Ekstrak Jahe Merah dengan Aquadest Menggunakan Metode Perebusan
1L aquadest yang mendidih ditambahkan ke 100 gram serbuk jahe merah dan dimasukkan ke dalam round bottom flask yang 1L. Selepas itu, diaduk dengan batang kaca selama 1 jam sampai dingin, Ekstrak difiltrasi dengan menggunakan kain saring.
Ekstrak yang difiltrasi kemudian dipanaskan lagi supaya aqudaest hilang dan dijadikan ekstrak kental yaitu konsentrasi 100%.
3.7.4 Metode Pengenceran Ekstrak Jahe Merah dengan Pelarut Aquadest 1. Pembuatan Larutan Konsentrasi 50%
Sebanyak 2,5 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 5 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
2. Pembuatan Larutan Konsentrasi 25%
Sebanyak 1,25 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 5 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
3. Pembuatan Larutan Konsentrasi 12,5%
Sebanyak 0,625 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 5 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
4. Pembuatan Larutan Konsentrasi 6,25%
Sebanyak 0,3125 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 5 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
5. Pembuatan Larutan Konsentrasi 3,125%
Sebanyak 0,15625 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 5 ml DMSO dan dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilabelkan.
3.7.5 Pembuatan Media Potatoes Dextrose Agar (PDA)
Cara pembuatannya, yaitu menggunakan timbangan digital untuk menimbang sebanyak 19,5 g potatoes dextrose agar (PDA) lalu dimasukkan ke dalam erlemenyer masukkan air suling 500 mL, lalu dipanaskan sampai larut, kemudian ditutup dengan pendopol dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121˚C (Oxoid). Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, maka media dipanaskan lagi hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
3.7.6 Pembiakan Spesimen
Biakan jamur Candida albicans dari strain utama diambil dengan 1 jarum ose dengan cara menggores dan 10 ml NaCl dimasukkan ke dalam tabung uji, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 22±2˚C selama 24-48 jam. Tabung uji yang akan diguna dimasukkan ke autoklaf pada suhu 121°C untuk disterilkan selama 15 menit, tunggu sampai dingin. 0,1 ml suspensi Candida albicans, 10 ml NaCl, dan setiap konsentrasi ekstrak sampel diambil 1 ml lalu dimasukkan ke 10 tabung uji masing-masing. Cawan petri yang akan diguna disteril di oven 170°C selama 1 jam. Setelah itu, masukkan 15 ml media Potatoes Dextrose Agar dan 1 ml dari tabung uji ke dalam cawan petri, homogenkan larutan. Tunggu sampai jadi agar dan masukkan ke dalam inkubator selama 24-48 jam.
3.7.7 Cara Perhitungan Jumlah Koloni dengan Metode Manual
Jumlah koloni jamur Candida albicans dihitung dengan menggunakan metode manual. Biakan yang dihitung diambil koloni yang tumbuh sesuai standar plat count yaitu 20-2720 koloni per cawan. Adapun cara menghitung koloni dengan menggunakan kaca pembesar dan dibagi empat kuadran:29
1. Satu koloni dihitung 1 koloni.
2. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
3. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
4. Dua koloni yang berhampiran dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
5. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidak dihitung.
6. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
7. Dari hasil perhitungan yang dilakukan, kemudian dihitung jumlah koloni dengan cara menambah semua koloni di setiap kuadrant.
3.7.8 Penentuan Kadar Hambat Minimum (KHM) Bahan Coba dengan Metode Agar Dilusi
Pada penelitian ini menggunakan 5 konsentrasi yakni 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%. Dari masing-masing konsentrasi ekstrak etanol dan aquadest, diambil 1 ml dalam tabung reaksi yang telah berisi media NaCl cair, kemudian ditambahkan 1 ml suspensi jamur Candida albicans dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba. Tabung bahan coba kemudian dikocok, lalu diinkubasi pada suhu 22°C selama 24 jam. Setelah itu, diambil dengan menggunakan mikropipet untuk tiap konsentrasi sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi 15 ml media Potatoes Dextrose Agar, homogenkan larutan dengan gerakan membentuk angka 8 hingga larutan memadat dan diamkan selama 15-20 menit. Setelah larutan menjadi agar, bungkus cawan petri dan dimasukkan ke dalam inkubator untuk diinkubasi dengan suhu 22-25°C selama 24-48 jam. Cawan petri dievaluasi untuk melihat ada atau tidak adanya pertumbuhan jamur Candida albicans setalah masa inkubasi. KHM didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari ekstrak yang menghambat pertumbuhan jamur Candida albicans di cawan petri. Kehadiran satu atau dua koloni itu dikesampingkan.
3.7.9 Penentuan Kadar Bunuh Minimum (KBM) Bahan Coba dengan Metode Agar Dilusi
Dari hasil prosedur penentuan nilai KHM dilanjutkan penentuan KBM.
Kemudian mengamati pertumbuhan koloni bakteri pada tiap-tiap media padat untuk menentukan nilai KBM dengan menggunakan kaca pembesar. KBM didefinisikan
sebagai konsentrasi terendah yang tidak menunjukkan pertumbuhan jamur Candida albicans di cawan petri.