Sasaran Percobaan
Sebelum melakukan percobaan mahasiswa harus memahami struktur asam amino, protein, monosakarida dan karbohidrat. Setelah melakukan percobaan ini dengan menggunakan pereaksi yang ada, diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan:
a. Perbedaan antara gula pereduksi dan bukan pereduksi.
b. Perbedaan antara disakarida yang mempunyai gugus aldehid (hemiasetal) atau keton (hemiketal), bebas dan tidak bebas.
c. Perbedaan asam amino dengan peptida atau protein serta perbedaan gugus samping dalam struktur asam amino.
I. Pendahuluan
Susu adalah makanan dengan nutrisi terlengkap di alam. Semua jenis susu, manusia maupun hewan,
mengandung vitamin (terutama tiamin, riboflavin, asam pantotenat, dan vitamin A, B12, dan D), mineral (kalsium,
kalium, natrium, fosfor dan logam renik), protein (terutama kasein), karbohidrat (terutama laktosa), dan lipid (lemak). Jumlah nutrisi yang terdapat dalam jenis susu yang berbeda juga beragam, namun susu sapi dan susu kambing memiliki kemiripan satu sama lain dalam hamper segala hal. Susu manusia mengandung kurang dari setengah kandungan protein dan mineral dibandingkan susu sapi dan kambing, tetapi hamper 1,5 kali lebih banyak kandungan gulanya. Susu kuda memiliki kandungan protein dan lemak yang rendah dibandingkan yang lain, sedangkan susu rusa memiliki kandungan protein, lemak dan mineral yang ringgi namun kandungan karbohidratnya rendah. Komposisi susu sapi adalah 87,1% air, 3,4% protein, 3,9% lemak, 4,9% karbohidrat, dan 0,7% mineral. Nutrisi yang tidak terkandung dalam susu hanyalah zat besi dan vitamin C.
Ada tiga macam protein susu: kasein, laktalbumin dan laktoglobulin, yang termasuk dalam “protein lengkap” karena terdiri atas semua jenis asam amino esensial yang diperlukan untuk membangun darah dan jaringan tubuh. Kasein adalah protein utama dalam susu, suatu fosfoprotein. Kasein dalam susu berada dalam bentuk garam kalsium kaseinat. Kalsium kaseinat memiliki titik isoelektrik pada pH 4,6 sehingga tidak larut dalam larutan pada pH kurang daripada 4,6. pH susu sekitar 6,6, sehingga kasein bermuatan negatif pada pH tersebut dan terlarut sebagai garam. Jika asam ditambahkan pada susu, muatan negatif pada permukaan luar misel kasein ternetralkan dan protein yang mengendap, dengan ion kalsium masih berada dalam larutan:
Ca-kaseinat + 2H+ → kasein + Ca2+
Ketika lemak dan protein telah dihilangkan dari susu, maka karbohidrat tertinggal dalam dadih dan terlarut dalam larutan. Karbohidrat utama dalam susu adalah laktosa. Laktosa (4-O-(β-D-galaktopiranosil)-D-glukopiranosa) adalah satu-satunya karbohidrat yang disintesis oleh mamalia. Laktosa merupakan disakarida yang terdiri atas satu molekul D-glukosa dan satu molekul D-galaktosa yang terikat dengan ikatan 1,4’-β-glikosidik.
O O O OH HO CH2OH OH HO HOH2C OH OH Gambar 1 Laktosa
Dalam percobaan ini kasein dan laktosa diisolasi dari susu sapi dan selanjutnya dilakukan serangkaian uji reaksi kimia terhadap kasein dan laktosa hasil isolasi.
II. Peralatan dan Zat
Tugas Anda adalah menyusun peralatan dan zat yang diperlukan dalam percobaan ini. III. Cara Kerja
A. Isolasi Kasein dan Laktosa dari Susu A.1 Isolasi Kasein
Timbang 25 gram susu bubuk low fat dan larutkan dalam 100 mL air hangat di dalam gelas kimia 250 mL
(suhu tidak melebihi 55 oC). Tambahkan tetes demi tetes larutan 10% asam asetat ke dalam susu sambil diaduk
cepat dengan batang pengaduk. Lanjutkan penambahan asam sampai dengan sekitar 2 mL, dengan tetap memanaskan gelas kimia di atas penangas air, sampai susu menjadi hampir bening dan kasein tidak terpisah lagi. Penting untuk diingat bahwa penambahan asam yang terlalu banyak dapat menghidrolisis laktosa sehingga akan mengurangi rendemen laktosa yang akan diisolasi pada percobaan berikutnya. Aduk endapan kasein sampai membentuk gumpalan, kemudian pindahkan gumpalan tersebut dari larutan ke dalam gelas kimia lain yang bersih. Tambahkan dengan segera kalsium karbonat ke dalam gelas kimia awal yang berisi cairan, aduk beberapa menit dan
ByDW2013
15
simpan untuk percobaan isolasi laktosa. Pemisahan laktosa harus segera dilakukan setelah pengerjaan tahap ini selesai. Kumpulkan kasein dengan penyaringan isap menggunakan corong Büchner untuk menghilangkan air. Tekan padatan dengan spatula. Simpan kasein di dalam gelas kimia 100 mL dan tambahkan 5 mL campuran 1:1 dietil eter dan etanol (HATI-HATI! TIDAK BOLEH ADA API!!!). Aduk kasein dalam eter selama beberapa menit, dekantasi eternya dan ulangi proses ini dengan menambahkan porsi kedua 5 mL dietil eter. Selanjutnya lakukan penyaringan isap dengan corong Büchner. Pencucian oleh dietil eter untuk menghilangkan sisa lemak yang ikut terendapkan dengan kasein. Keringkan kasein dengan berlapis-lapis kertas isap dan biarkan 10 – 15 menit. Sambil menunggu, lakukan percobaan berikutnya untuk mengisolasi laktosa (percobaan A.2). Bagi dua produk kasein yang diperoleh dan timbang masing-masing bagiannya. Simpan porsi yang pertama dalam Erlenmeyer 125 mL, tambahkan 35 mL air dan 0,5 mL larutan NaOH 1M. Tutup Erlenmeyer dan guncangkan agar sebanyak mungkin kaseinnya larut. Simpan untuk uji reaksi kimia protein. Bagian yang kedua dibiarkan kering, kemudian timbang dan hitung rendemen total kasein dalam susu bubuk.
A.2 Isolasi Laktosa
Perlahan panaskan cairan dalam gelas kimia awal yang berasal dari percobaan A.1 yang telah ditambahkan kalsium karbonat. Aduk dengan teratur untuk menghindari bumping. Larutan akan berbuih seperti mendidih. Tahap ini untuk mengendapkan sisa protein yang masih ada (laktalbumin dan laktoglobulin). Lakukan penyaringan isap terhadap larutan panas sehingga protein dan kalsium karbonat dapat tertahan di kertas saring. Pindahkan filtrat panas yang berwarna kekuningan ke dalam Erlenmeyer 125 mL dan pekatkan sampai volume filtrat 5 mL dengan pemanasan sambil diaduk untuk menghindari bumping. Ke dalam larutan panas yang telah pekat, tambahkan 25 mL etanol 95% panas dan 0,01 gram karbon aktif. Simpan campuran ini dan dinginkan. Ke dalam campuran ini tambahkan 1 mL air, kemudian saring dengan pengisapan menggunakan corong Hirsch. Pastikan filtratnya bening, apabila masih keruh, lakukan pemanasan lagi dan kemudian didinginkan kembali. Tambahkan lagi 0,5 mL air, dan lakukan kembali penyaringan isap dengan corong Hirsch. Pindahkan filtrat ke dalam labu Erlenmeyer 125 mL, panaskan sampai bening, dan dinginkan secara perlahan. Tutup labu dan biarkan sampai terbentuk kristal laktosa. Bila belum muncul juga, dinginkan filtrat di dalam es. Bila belum muncul juga, lakukan pemekatan filtrat kembali. Saring kristal laktosa dengan penyaringan isap dan cuci dengan sedikit etanol 95% dingin. Keringkan laktosa di udara, timbang dan tentukan titik lelehnya. Tentukan persen rendemen laktosa terhadap susu bubuk awal.
B. Uji Kimia Protein dan Karbohidrat B.1 Uji Kimia Protein dan Asam Amino
Reagen yang diuji: kasein hasil isolasi dari percobaan A.1, tirosin, glisin dan sistein. B.1.1 Uji Millon
Uji Millon untuk mengidentifikasi senyawa yang mengandung gugus hidroksi fenolik.
Masukkan 1 mL larutan kasein dan larutan tirosin 0,1 M ke dalam tabung reaksi yang berbeda. Beri label masing-masing tabung reaksi. Tambahkan 3 tetes reagen Millon dan celupkan tabung reaksi di dalam penangas air yang mendidih selama 5 menit. Dinginkan tabung dan catat perubahan warna yang terjadi.
B.1.2 Uji Ninhidrin
Reaksi ninhidrin digunakan untuk mendeteksi adanya asam α-amino dan protein yang mengandung gugus amina bebas. Ketika dipanaskan dengan ninhidrin, molekul-molekul tersebut akan memberikan warna biru tua atau terkadang kuning pucat. Reaksi yang terlibat:
Masukkan 1 mL larutan kasein dan larutan glisin 0,1 M ke dalam dua tabung reaksi yang berbeda. Beri label masing-masing tabung. Tambahkan 4 tetes larutan ninhidrin 0,1%. Tambahkan batu didih ke dalam tiap tabung reaksi dan panaskan dalam penangas air. Catat hasil yang terjadi.
B.1.3 Uji Sulfur
Adanya belerang dalam asam amino seperti sistein dapat ditentukan dengan mengubah sulfur menjadi sulfida anorganik melalui pemutusan ikatan oleh basa. Hasilnya menunjukkan endapan warna hitam timbal sulfida, jika larutan tersebut direaksikan dengan timbal asetat. Masukkan 1 mL larutan kasein dan larutan sistein 0,1 M ke dalam dua tabung reaksi berbeda. Beri label masing-masing tabung. Tambahkan 2 mL larutan NaOH 10% dan tambahkan 5 tetes larutan timbal asetat 10%. Tutup tabung reaksi dan guncangkan, lalu buka tutupnya dan panaskan dalam penangas air selama 5 menit. Dinginkan dan catat hasilnya.
B.1.4 Reaksi dengan asam nitrit
a). Tambahkan 0,1 g glisin di dalam tabung reaksi dan tambahkan 5 mL larutan HCl 10%. Di dalam tabung reaksi
yang lain, tambahkan 5 mL larutan HCl 10%, sebagai pembanding. Dinginkan kedua tabung reaksi sampai 0 oC di
dalam air es. Ke dalam masing-masing tabung reaksi tambahkan dengan hati-hati 1 mL larutan NaNO2 5%, dan catat
hasilnya.
b). Dinginkan larutan kasein yang sudah disiapkan diatas (c) dalam air es, lalu tambahkan 1 mL larutan NaNO2 5%,
catat.
B.1.5 Uji Biuret
a). Tempatkan 0,5 g urea di dalam tabung reaksi yang kering dan panaskan perlahan-lahan sampai urea meleleh dan
gas N2 terbentuk. Catat bau gas dan uji dengan kertas lakmus basah di mulut tabung reaksi. Lanjutkan pemanasan
sampai pembentukan gas berhenti dan sisanya mulai padat. Dinginkan, lalu larutkan zat padat dalam 3 mL air suling
panas. Saring larutan dan tambahkan kepada filtrat 2 mL larutan NaOH 10%, kemudian 2-3 tetes larutan CuSO4 2%.
Aduk larutan dan amati warnanya. Sebagai pembanding, larutkan 0,5 g urea dalam 3 mL air, tambahkan 2 mL
larutan NaOH 10%, kemudian tambahkan 2-3 tetes larutan CuSO4 2%. Bandingkan hasilnya dengan pengamatan di
atas!
b). Kepada 2 mL larutan kasein yang disediakan di atas (c) tambahkan 2 mL air suling dan 2 tetes larutan CuSO4 2%,
aduk dan amati! B.1.6 Uji Xanthoproteat
Tempatkan 0,1 g kasein dalam tabung, tambahkan 2 mL asam nitrat pekat, panaskan perlahan-lahan. Amati warna yang terjadi. Dinginkan campuran reaksi, netralkan hati-hati dengan larutan NaOH 10%, dan tambahkan sedikit basa berlebih. Catat jika terjadi perubahan warna larutan.
B.2 Uji Kimia untuk Karbohidrat
Reagen yang diuji untuk uji 1 dan 2: sampel laktosa hasil isolasi dari susu, glukosa, fruktosa, sukrosa, maltosa. B.2.1 Uji Molisch
Ke dalam 2 mL larutan gula yang akan diuji, tambahkan 2 tetes larutan alfa naftol 1,5 M dalam etanol. Ke dalam
tabung reaksi kedua, tempatkan 2 mL H2SO4 pekat, dan tuangkan larutan gula ke dalamnya melalui sisi tabung,
sedemikian rupa sehingga larutan mengapung pada permukaan asam tanpa terjadi pencampuran. Amati perubahan warna pada batas kedua cairan.
B.2.2 Uji Benedict
Uji Benedict bertujuan untuk menentukan apakah monosakarida atau disakarida merupakan gula pereduksi atau bukan, yang menyerupai uji Tollens untuk gugus aldehid dan keton. Agar ujinya positif, suatu karbohidrat harus mengandung gugus hemiasetal yang akan terhidrolisis dalam larutan menjadi bentuk aldehidnya. Reaksinya:
RCHO + 2Cu2+ + 4OH− → RCOOH + Cu2O + 2H2O
Masukkan 15 tetes larutan 1% masing-masing sampel karbohidrat yang tersedia ke dalam tabung reaksi yang berbeda. Beri label tiap tabung reaksi tersebut. Masukkan 1 mL aquadest ke dalam tabung reaksi lainnya sebagai kontrol. Ke dalam masing-masing tabung reaksi, tambahkan 1 mL reagen Benedict dan panaskan tabung dalam penangas air panas selama 5 menit. Amati dan catat hasilnya.
B.2.3 Uji Barfoed
Uji Barfoed mirip dengan uji Benedict, tetapi tujuannya untuk menentukan apakah suatu karbohidrat merupakan monosakarida atau disakarida. Reagen Barfoed bereaksi dengan monosakarida menghasilkan endapan tembaga(I)oksida dengan laju reaksi lebih cepat daripada disakarida. Reaksinya:
ByDW2013
17
Masukkan 15 tetes larutan 1% masing-masing sampel karbohidrat yang tersedia ke dalam tabung reaksi yang berbeda. Beri label tiap tabung reaksi tersebut. Ke dalam masing-masing tabung reaksi, tambahkan 1 mL reagen Barfoed dan panaskan tabung dalam penangas air panas selama 10 menit. Amati dan catat hasilnya.
B.2.4 Uji Hidrolisis Glukosa
Disakarida dan polisakarida dapat terhidrolisis di dalam larutan asam menjadi monosakarida penyusunnya, dan kemudian dilakukan uji kimia seperti uji Benedict. Uji kandungan glukosa dapat dilakukan menggunakan Tes-Tape (Glucotest®). Tape ini tersedia secara komersial di toko obat, dan mengandung enzim glukosa oksidase dan peroksidase, serta orto-toluidin. Glukosa oksidase mengoksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen peroksida. Selanjutnya hidrogen peroksida akan bereaksi dengan peroksidase menghasilkan oksigen yang mengoksidasi orto-toluidin menghasilkan produk berwarna hijau.
Masukkan 5 mL larutan 10% karbohidrat berikut: sukrosa, laktosa hasil isolasi, maltosa dan larutan kanji, ke dalam tabung reaksi berbeda. Beri label tiap tabung reaksi. Tambahkan 3 tetes HCl pekat (lakukan di lemari asam!!) ke dalam tiap tabung reaksi, dan panaskan dalam penangas air panas (gelas kimia 400 mL) selama 10 menit. Dinginkan tabung reaksi perlahan di suhu kamar, lalu di dalam penangas es. Secara hati-hati netralkan tiap tabung reaksi dengan larutan NaOH 10% menggunakan kertas lakmus. Jika perlu, lakukan penyesuaian pH dengan menambahkan larutan NaOH 0,1 M (apabila masih asam) atau larutan HCl 0,1 M (apabila terlalu basa). Uji tiap larutan dengan meneteskan 1 tetes larutan pada Tes-Tape dan catat perubahan warna yangterjadi. Lakukan pula uji pada aquadest sebagai kontrol. Jika waktu masih memungkinkan, lakukan uji Benedict terhadap tiap larutan yang telah terhidrolisis dan bandingkan hasilnya dengan hasil percobaan B.2.2 di atas.
CHO C OH H C H HO C OH H C OH H CH2OH CHO C OH H C H HO C OH H C OH H CH2OH Glukosa oksidase + H2O2 2 H2O2 peroksidase 2 H2O + O2 CH3 NH2 + O2 orto-Toluidin produk berwarna
Gambar 3 Uji oksidasi glukosa dengan enzim glukosa oksidase dan peroksidase IV. Tugas Pendahuluan
1. Komponen apa dalam susu yang bertanggung jawab terhadap putihnya warna susu? 2. Mengapa laktosa lebih larut dalam air daripada dalam etanol?
3. Mengapa molekul disakarida memiliki massa molekul yang tidak persis dua kali massa molekul monosakaridanya?
4. Jelaskan apa yang dimaksund dengan istilah “gula pereduksi”, dan struktur sakarida yang seperti apa yang menyebabkan molekul tersebut disebut demikian?
5. Tuliskan mekanisme reaksi lengkap untuk proses hidrolisi laktosa yang dikatalisis asama menjadi monosakaridanya. Apakah reaksi dapat berlangsung dalam suasana basa? Mengapa?
6. Rotasi spesifik α- dan β-laktosa adalah +92,6o dan + 34,2o. Ketika α-laktosa dilarutkan dalam air pada suhu
kamar, putaran optik larutan berubah dari +92,6o menjadi +52,3o. Ketika etanol ditambahkan ke dalam larutan,
α-laktosa murni mengkristal dari larutannya. Jelaskan apa yang terjadi, gunakan mekanisme reaksi lengkap untuk membantu Anda menjelaskan fenomena-fenomena di atas!
Pustaka
Helmkamp, G.K., and Johnson, Jr., H.W. (1964), Selected Experiments in Organic Chemistry, H. Freeman and Company, San Fransisco & London, p. 128
Wilcox, C.F. dan Wilcox, M. F. (1998), Experimental Organic Chemistry. A Small Scale Approach, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, p. 506