HASIL PENELITIAN
5.2 Pulasan Bcl-2 pada sampel penelitian
Pada hasil analisa uji statistik pada penelitian ini menunjukkan bahwa perbedaan ekspresi 2 pada kedua subtipe bermakna. Nilai rerata ekspresi Bcl-2 non-GCB lebih tinggi daripada subtipe GCB. Penelitian lain tentang ekspresi Bcl-2 pada kedua subtipe dilakukan oleh Neto et al. Pada hasil penelitian tersebut disimpulkan bahwa perbedaan ekspresi Bcl-2 pada kedua subtipe tidak bermakna.17
Ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB dan non-GCB sangat bervariasi hasilnya. Pada DLBCL subtipe non-GCB diketahui ekspresi Bcl-2 lebih tinggi, hal tersebut dapat terjadi karena berhubungan dengan patogenesis Bcl-2 pada DLBCL subtipe non-GCB. Pada subtipe non-GCB, Bcl-2 berperan serta dalam amplifikasi dan aktivasi Nf-kappaB. Pada tahapan aktivasi Nf-kappaB ini terjadi proliferasi sel sehingga nilai apoptosis yang ada sangat rendah, atau survival sel yang tinggi. Dalam hal tersebut dapat disimpulkan bahwa ekspresi Bcl-2 sebagai anti apoptotik menjadi tinggi.35
Dalam beberapa studi dikatakan bahwa ekspresi Bcl-2 yang tinggi berhubungan dengan respon terapi yang lebih buruk. Pada penelitian lain yang menggunakan metode pemeriksaan Southern blotting ditemukan bahwa pengaturan gen Bcl-2 tidak berhubungan dengan ketahanan hidup pasien DLBCL.16,24
25
Universitas Indonesia
Dalam penelitian yang dilakukan ini tidak dilakukan penilaian faktor prognosis, yang dapat diketahui dari pemeriksaan secara klinis pada pasien sebelum dan setelah dilakukan terapi standar. Dari data yang dikumpulkan berdasarkan arsip rekam medis pusat di RSCM, sebagian besar pasien telah mendapat terapi standar berupa R-CHOP. Sebagian pasien yang lain belum mendapat terapi standar, dikarenakan kondisi pasien yang kurang stabil dan perlu pemulihan kondisi secara umum. Jumlah pasien yang belum dilakukan terapi di RSCM lebih sedikit dari total jumlah pasien pada penelitian ini.
Dalam penelitian ini digunakan cut off penilaian Bcl-2 yaitu 31%, hal tersebut diketahui berdasarkan hasil analisa statistik dengan kurva ROC dari data yang ditemukan. Pada beberapa studi penilaian ekspresi Bcl-2 memakai cut off yang bervariasi, dengan nilai 45% atau berkisar 10% - 70%. Belum ada standar baku yang diterapkan pada penilaian cut off Bcl-2 ini.14,39
Pulasan Bcl-2 yang positif akan terekspresi di sitoplasma dan membran inti sel. Hal ini sesuai dengan penilaian Bcl-2 pada penelitian yang dilakukan oleh Suri et al pada kasus karsinoma sel skuamosa. Pada penelitian ini seluruh kasus menunjukkan CD20 positif yang terpulas pada membran sitoplasma dan sebagian besar mengekspresikannya secara difus.39
Menurut beberapa penelitian hasil pulasan Bcl-2 dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti jenis klon antibodi yang dipakai. Peneliti lain merekomendasikan penggunaan antibodi Bcl-2 yang dihasilkan oleh Dako 124 dengan pengenceran dua ratus kali. Pada penelitian ini dipakai antibodi Bcl-2 yang diproduksi oleh Biocare, dengan jenis klon 100/D5 serta pengenceran sampai seratus kali.40
Analisis statistik pada penelitian ini menunjukkan sebaran data yang tidak normal. Setelah dilakukan penilaian uji non-parametrik Mann-Whitney diketahui bahwa ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB dan non-GCB berbeda bermakna dengan nilai p<0,05.
Dari penelitian ini didapatkan adanya kecenderungan ekspresi Bcl-2 lebih tinggi pada subtipe non-GCB daripada subtipe GCB. Jika dihubungkan dengan patogenesis Bcl-2 pada subtipe non-GCB, hal ini sesuai dengan teori yang ada.
Menurut teori pada DLBCL subtipe non-GCB terjadi proliferasi sel akibat aktivasi NfkappaB oleh Bcl-2.35
Dalam penelitian yang dilakukan oleh Neto et al, didapatkan nilai ekspresi Bcl-2 lebih tinggi pada DLBCL subtipe GCB daripada non-GCB. Berdasarkan kepustakaan dikatakan bahwa nilai ekspresi Bcl-2 yang tinggi menunjukkan prognosis yang lebih buruk pada pasien yang telah dilakukan terapi standar. Pada penelitian lanjutan yang lain dikatakan bahwa ekspresi Bcl-2 yang tinggi disertai pemeriksaan ekspresi Bcl-6 dan Myc yang tinggi juga menunjukkan prognosis yang lebih buruk, dalam hal ini penilaian prognosis berdasarkan pada skor IPI.17
Penanda yang lain untuk menilai prognosis DLBCL dapat dilakukan secara pemeriksaan jenis morfologik, imunofenotip dan pemeriksaan profil genetik. Pada hampir semua pemeriksaan dibutuhkan cara yang sangat komplek serta kebutuhan akan jaringan yang masih baru/ fresh tissue. Pada penelitian lanjutan lain terapi sudah dilakukan dengan salah satu targetnya adalah Bcl-2, sehingga mutasi BCL-2 secara klinik sangat bermakna dalam terapi pasien DLBCL.25
Johnson et al juga meneliti ekspresi Bcl-2 dan Myc pada kelompok pasien DLBCL yang mendapatkan terapi regimen standar dengan R-CHOP. Secara prospektif mereka meneliti 167 pasien DLBCL dari 10 institusi di seluruh dunia. Penilaian ekspresi Bcl-2 positif jika memulas ≥ 50% sel dan Myc positif jika memulas ≥ 40% sel. Mereka menemukan bahwa terdapat ekspresi bersama Bcl-2 dan Myc pada sekitar 21% kasus, dimana ekspresi Myc saja tidak berhubungan secara bermakna dengan kesintasan pasien yang telah diberikan terapi regimen standar dengan R-CHOP. Walaupun ekspresi Myc saja dikatakan tidak berhubungan bermakna dengan kesintasan pasien, akan tetapi bila digabungkan dengan ekspresi Bcl-2, maka didapatkan baik progression-free survival (PFS) maupun overall survival (OS) menjadi lebih rendah secara bermakna.14
Dalam penelitian ini telah dinilai ekspresi Bcl-2 dari 41 sampel yang ditemukan selama dua tahun. Dari laboratorium PA RSCM diperoleh 27 sampel, sedangkan dari luar RSCM diperoleh 14 sampel. Keseluruhan sampel di review untuk menentukan subtipe DLBCL. Seluruh sampel dilakukan pemeriksaan Bcl-2 dengan metode imunohistokimia di laboratorium Patologi Anatomi RSCM.
27
Universitas Indonesia
Pemakaian kriteria Hans sebagai salah satu upaya untuk mengklasifikasikan DLBCL menjadi subtipe GCB dan non-GCB dapat diterapkan dengan biaya yang lenih murah dan sarana yang lebih sederhana. Menurut para ahli pemeriksaan genetik dan penggolongan menjadi subtipe bisa digunakan sebagai salah satu cara dalam merencanakan terapi pasien DLBCL selanjutnya. Pasien DLBCL menerima terapi regimen standar R-CHOP sesuai dangan protokol internasional, pada beberapa pasien belum diberikan terapi karena kondisi klinis yang kurang memungkinkan. Jika dikonversikan, pemeriksaan imunohistokimia dengan pemeriksaan DNA microarray, maka pemeriksaan imunohistokimia lebih murah dan efisien serta dapat dilakukan dengan segera di negara-negara berkembang seperti di Indonesia. Dengan mengetahui klasifikasi berdasarkan kriteria Hans, maka dapat digali informasi yang lebih spesifik pada pasien DLBCL. Berdasarkan semua data yang dikumpulkan belum dapat ditarik kesimpulan bermakna tentang hubungan ekspresi Bcl-2 dengan respon pengobatan pada pasien DLBCL. Dari penelitian ini diketahui bahwa ekspresi Bcl-2 pada subtipe non-GCB lebih tinggi secara bermakna dibandingkan subtipe GCB, sehingga pemeriksaan ekspresi Bcl-2 dapat direkomendasikan sebagai salah satu penanda subtipe dari pasien DLBCL.8
Dalam beberapa kepustakaan dikatakan bahwa DLBCL subtipe GCB memiliki kesintasan yang lebih baik jika dibandingkan dengan DLBCL subtipe GCB, dari pasien DLBCL yang didapatkan pada penelitian ini subtipe non-GCB lebih banyak jumlahnya daripada subtipe non-GCB, informasi tambahan ini sangat bermanfaat bagi dokter yang memberikan pengobatan pada pasien DLBCL. Menurut protokol standar internasional penilaian kondisi klinik pasien DLBCL mengacu pada penetapan stadium dengan sistem Ann Arbor dan penilaian respon terapi dengan skor IPI. Dari data yang didapatkan pada penelitian ini, belum ada keseragaman dalam pelaporan status pasien DLBCL yang ditemukan. Sehingga untuk memprediksi prognosis selanjutnya juga belum dapat dilakukan dengan baik.7
6.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang ditemukan dan analisis statistik data yang diperoleh, dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1.Ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe non-GCB lebih tinggi daripada ekspresi Bcl-2 pada DLBCL subtipe GCB.
2. Bcl-2 dapat digunakan sebagai salah satu penanda subtipe GCB dan non-GCB pada DLBCL dengan menggunakan nilai cut off sebesar 31%.
3.Semua kasus GCB pada penelitian ini memberikan hasil positif untuk pulasan antibodi CD10.
6.2 Saran
Perlu kelengkapan data klinik dan laboratorium pasien untuk menilai prognosis atau respon terapi pasien. Hasil penelitian ini dapat dijadikan acuan untuk melakukan penelitian lanjutan berikutnya.
29
Universitas Indonesia
Daftar Pustaka
1. Stein H, Warnke RA, Chan W, Jaffe E, Gatter K, Campo E, et al.In : Stein H, ed. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon : International Agency for Research on Cancer; 2008. p.233-7.
2. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Isaacson PG. Classification of lymphoid neoplasm: the microscope as a tool for disease discovery. Blood. 2008 ;112:4384-94.
3. Reksodiputro AH, Irawan C, Hardjolukito E, Suzanna E, Rinaldi I, Mulansari N, et al. Non-Hodgkin lymphoma in Jakarta. Indon J Cancer. 2011; 5: 129-33.
4. Dennis P, Malley O, Auerbach A, Weiss LM. Practical applications in immunohistochemistry : evaluation of diffuse large B-cell lymphoma and related large B-cell lymphomas. Arch Pathol Lab Med. 2014 ;14: 1-10. 5. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, et al.
Distinct types of diffuse large B-Cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 2000; 403: 503-10.
6. Akyurek N, Uner A, Benekli M, Barista I. Prognostic significance of MYC, BCL2, and BCL6 rearrangements in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone plus rituximab. Cancer. 2012 ; 118: 4173-83.
7. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, Connors JM, Campo E, Fisher RI, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large B-Cell lymphoma. N Engl J Med. 2002 ; 346: 193-6. 8. Hans CP, Weisenburger D, Greiner TC, Gascoyne R, Delabie J, Ott G, et
al. Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray. Blood. 2013; 21: 1-34.
9. Choi WWL, Weisenburger D, Greiner TC, Piris MA, Banham AH, Delabie J, et al. A new immunostain algorithm classifies diffuse large B-cell lymphoma into molecular subtypes with high accuracy. Clin Cancer Res. 2009; 15: 5494-98.
10. Bodoor K, Matalka I, Hayajneh R, Haddad Y, Gharaibeh W. Evaluation of BCL-6, CD10, CD138 and MUM-1 expression in diffuse large B-cell lymphoma patients: CD138 is a marker of poor prognosis. As Pac J Cancer Prev. 2012; 13: 3037-40.
11. Tilly H, Vitolo U, Walewski J, Silva MG, Shpilberg O, Andre M, et al. Diffuse large B-cell lymphoma : ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow up. Ann Oncol. 2012 ; 23: 1-3.
12. Amitage JO. How I treat pateints with diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 2007; 110:29-36.
13. Horn H, Ziepert M, Becher C, Barth TF, Bernd HW, Feller AC, et al. Myc status in concert with BCL2 and BCL6 expression predicts outcome in diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 2013 ; 121 :2253-9.
14. Johnson NA, Slack GW, Savage KJ, Connors JM, Ben-Neriah S, Rogic S, et al. Concurrent expression of MYC and BCL-2 in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol. 2012 ; 30 : 3452-9.
15. Green TM, Young KH, Visco C, Xu-Monette ZY, Orazi A, Go RS, et al. Immunohistochemical double-hit score is is a strong predictor of outcome in patiens with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol. 2012 ; 30 : 3460-7.
16. Schuetz JM, Johnson NA, Morin RD, Scott DW, Tan K, Nierah SB, et al. BCL2 mutations in diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia. 2012 ; 26 : 1383-90.
17. Neto AEH, Siquera SA, Dulley F, Chauobah A, Belesso M, Saboia R,et al. Bcl-2 protein frequency in patients with high-risk diffuse large B-cell lymphoma. Sao Paulo Med. 2010 ; 128 : 14-7.
18. Tsujimoto Y. Bcl-2 family of proteins: life or death switch in mitochondria. Biosci Rep.2002 ;22 :47-52.
19. Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Gen Dev. 1999 ; 13 : 1899-1905.
20. Cultrera J, Dalia SM. Diffuse Large B-Cell Lymphoma : Current strategies and future directions. Cancer Cont. 2012 ; 19 :204-12.
21. Fisher RI. Advanced insight into the biology of malignant lymphomas. J Clin Oncol. 2011 ; 29 : 1799-800.
22. Weiss LM, editor. Diffuse large B-cell lymphoma. Lymph nodes 1st
ed. New York: Cambridge University ; 2008. p. 123-4.
23. Habara T, Sato Y, Takata K, Okumura H, Sonobe H, et al. Germinal center B-cell like versus non germinal center B-cell like as important prognostic factor localized nodal DLBCL. J Clin Exp Hematopathol. 2012; 52: 91-9.
24. Visco C, Tzankov A, Xu-Monette ZY, Miranda RN, Tai YC, Li Y, et al. Patients with diffuse large B-cell lymphoma of germinal center origin with BCL2 translocations have poor outcome, irrespective of MYC status : a report from an International DLBCL rituximab-CHOP Consortium Program Study. Haematol. 2013 ; 98 : 255-63.
25. Coutinho R, Gribben J. Biomarkers of difffuse large B–cell lymphoma : impact on diagnosis, treatment, and prognosis. Curr Biomark Find. 2013; 3: 17-24.
26. Petrich AM, Gandhi M, Jovanovic B, Castillo J, Rajguru S, Yang DT, et al. Impac of induction regimen and stem cell transplantion on outcomes in double-hit lymphoma : a multicenter retrospective analysis. Blood. 2014 ; 124:2354-59
27. Aukema SM, Siebert R, Schuuring E, van Imhoff GW, Kluin-Nelemans HC, Boerma EJ, et al. Double-hit B-cell lymphoma. Blood. 2011; 117: 2319-31.
31
Universitas Indonesia
28. Thieblemont C, Briere J. Myc, Bcl-2, Bcl-6 in DLBCL: impact for clinics in the future? Blood. 2013 ; 121 : 2165-6.
29. Schuetz JM, Johnson NA, Morin RD, Scott DW, Tan K, Nierah SB, et al. BCL2 mutations in diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia. 2012; 26: 1383.
30. Din AS, Kale J, Leber B, Andrews DW. Mechanisms of Action of Bcl-2 Family Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013; 5: 1-10.
31. Willis S, Day CL, Hinds MG, Huang DC. The Bcl-2 regulated apoptotic pathway. J Cell Sci. 2003; 116: 4053-56.
32. Nunez G, Clarke MF. The Bcl-2 family of proteins : regulators of cell death and survival. Trends Cell Biol. 1994; 4: 395-99.
33. Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Gen Dev. 1999; 13: 1899-1911.
34. Oh YJ, Wong SC, Moffat M, Malley KL. Overexpression of Bcl-2 attenuates MPP, but not 6-ODHA, induced cell death in a dopaminergic neuronal cell line. Neurobiol Dis. 1995; 2: 157-67.
35. Dunleavy K, Wilson H. The differential role of Bcl-2 within molecular subtypes of DLBCL. Clin Cancer Res. 2011; 15: 7505-07.
36. Green M, Gandhi M, Camilleri E, Marlton P, Lea R, Griffiths L. High levels of BACH2 associated with lower levels of BCL2 transcript abundance in t(14;18)(q21;q34) translocation positive Non-Hodgkin’s Lymphoma. Genomics. 2014;1-7.
37. Haberle MT, Kelsch E, Dorsch K, Moller P, Ritz O. Knock-down of BCL6/ STAT6 sensitizes primary B cell lymphoma cells for treatment with current therapeutic agents. Oncosci. 2014; 4: 283-5.
38. Madiyono B, Moeslichan S, Sastroasmoro A, Budiman I, Purwanto SH. Perkiraan besar sampel. Dalam: Sastroasmoro S, Ismael S, eds. Dasar-dasar metodologi penelitian klinis, edisi ke-3 Jakarta: Sagung Seto, 2010; h.314-7.
39. Suri C. The immunohistochemical evaluation of the expression of BCL2 in different histological grades of squamous cell. J Clin Diagn Res. 2009; 3: 1891-9.
40. Tsutsui S, Yasuda K, Suzuki K, Takeuchi H, Nishizaki T, Higashi H, et al. Bcl-2 protein expression is associated with p27 and p53 protein expression and MIB-1 counts in breast cancer. Cancer. 2006; 6:1-7.