BAB IV: DESKRIPSI DAN ANALISIS DATA
3. Penapisan Fitokimia
Bahan-bahan yang digunakan dalam uji fitokimia adalah H2SO4 2 M, H2SO4 pekat, kloroform, HCl pekat, asetat anhidrat, serbuk Mg, FeCl3, ammoniak 10%, tembaga asetat, reagen Mayer, reagen Dragendorff, HCl 2 N, kertas saring dan aluminium foil.
4. Uji Kadar Steroid
Pengujian kadar steroid dibutuhkan larutan asam klorida 0,5 N, etil asetat, serta amil alkohol pekat.
5. Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan dibutuhkan larutan DPPH, larutan fraksi n-heksana daun gugur ketapang, larutan kuersetin dan larutan asam askorbat sebagai senyawa pembanding, serta etanol absolut.
F. Prosedur Kerja
Prosedur kerja pada penelitian ini diawali dengan penyiapan simplisia. Simplisia kemudian diekstraksi. Hasil ekstraksi selanjutnya dievaporasi, sehingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental selanjutnya dikeringkan.
Ekstrak yang diperoleh dilakukan uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan.
1. Penyiapan Sampel
Tahap awal dilakukan pengumpulan daun gugur ketapang yang diambil di kampus II UIN Walisongo Semarang. Pengotor pada daun gugur ketapang dicuci dengan air mengalir. Daun diperkecil ukurannya dengan cara dipotong-potong menggunakan gunting. Daun gugur dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruang tanpa terpapar sinar matahari langsung.
Daun yang telah kering (simplisia) dihaluskan dengan blender. Serbuk simplisia diangin-anginkan kembali hingga kering. Serbuk simplisia dimasukkan dalam kantong plastik dan disimpan pada suhu ruang tanpa terpapar sinar matahari langsung (Garcia et al., 2012).
2. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Gugur Ketapang Serbuk simplisia ditimbang dua kali dengan neraca analitik masing-masing sebanyak 500 gram. Hasil timbangan masing-masing dimasukkan kedalam toples kaca. Serbuk simplisia dimaserasi menggunakan pelarut etanol 96% hingga 3-5 cm diatas serbuk simplisia . Tutup toples kaca dengan rapat dan diamkan selama 24 jam.
Campuran disaring dan hasil maserasi ditampung di toples kaca. Residu diremaserasi hingga diperoleh
ekstrak cair yang bening. Seluruh hasil maserasi (maserat) dikumpulkan, lalu diuapkan dengan vacuum rotary evaporator, sehingga dihasilkan ekstrak kental.
Hasil ekstrak ditimbang untuk dihitung rendemennya.
3. Fraksinasi Ekstrak
Fraksinasi dilakukan dengan metode partisi cair-cair. Ekstrak kental etanol daun gugur ketapang didispersi dalam 100 ml campuran air panas dan etanol 96% dengan perbandingan 9:1. Campuran selanjutnya dimasukkan kedalam corong pemisah. Campuran kemudian dipartisi dengan menambahkan 150 ml n-heksana dan dikocok hingga homogen untuk memungkinkan pelarut melarutkan analit secara sempurna. Campuran selanjutnya didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan ekstrak air (lapisan bagian bawah) dipisahkan dengan lapisan fraksi n-heksana (lapisan bagian atas). Lapisan air direfraksinasi dengan pelarut n-heksana hingga tiga kali pengulangan (Madikizela et al., 2014).
Fraksi n-heksana yang dihasilkan diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator, sehingga diperoleh fraksi heksana yang kental. Fraksi n-heksana selanjutnya ditimbang untuk dihitung
rendemennya. Fraksi n-heksana daun gugur ketapang disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4 oC.
4. Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia digunakan untuk mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam fraksi n-heksana daun gugur ketapang.
a. Alkaloid 1) Uji Mayer
1 ml sampel ditambahkan 2-3 tetes reagen Mayer. Terbentuknya endapan berwarna kuning menunjukkan adanya alkaloid (Tiwari et al., 2011).
2) Uji Dragendorff
1 ml sampel ditambahkan 2-3 tetes reagen Dragendroff. Terbentuknya endapan jingga hingga merah menunjukkan adanya alkaloid (Mangela et al., 2016; Tiwari et al., 2011).
b. Flavonoid 1) Uji Shinoda
1 ml larutan sampel ditambahkan sedikit serbuk magnesium dan beberapa tetes HCl pekat.
Terbentuknya larutan berwarna jingga, merah
muda, atau merah menunjukkan adanya flavonoid (Mangela et al., 2016).
2) Uji Timbal Asetat
1 ml larutan timbal asetat ditambahkan ke dalam 5 ml larutan ekstrak. Terbentuknya flok-flok endapan berwarna putih menunjukkan adanya flavonoid (Kumoro, 2015).
c. Steroid dan Triterpenoid 1) Uji Libermann-Burchard
1 ml sampel ditambahkan beberapa tetes asam asetat anhidrat, kemudian dididihkan dan didinginkan. Asam sulfat pekat dituangkan secara perlahan melalui dinding tabung reaksi.
Terbentuk cincin berwarna coklat pada pertemuan dua lapisan dan lapisan atas berubah menjadi warna hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkan terbentuk warna merah menunjukkan adanya triterpenoid (Kumoro, 2015).
2) Uji Salkowski
1 ml sampel ditambahkan dengan beberapa tetes asam sulfat pekat. Adanya steroid ditandai terbentuknya warna merah pada lapisan bawah, sedangkan adanya triterpenoid ditandai
terbentuknya warna kuning pada lapisan bawah (Kumoro, 2015).
d. Saponin
1 ml ekstrak dan 1 ml etanol dituangkan dalam tabung reaksi. 20 ml akuades ditambahkan dan dikocok selama 15 menit. Terbentuknya buih yang stabil setinggi ยฑ 1 cm selama kurang lebih 20 menit menunjukkan adanya saponin (Kumoro, 2015).
e. Fenol
1 ml ekstrak sampel ditambahkan dengan 3 tetes FeCl3 0,1%. Terbentuk larutan berwarna hijau, hijau biru, atau hitam kebiruan menunjukkan adanya fenol (Tiwari et al., 2011).
f. Tanin
1 ml ekstrak ditambahkan 2 ml akuades di tabung tabung uji. Ditambahkan 2-3 tetes FeCl3 1%.
Terbentuknya warna biru-hijau menunjukkan adanya tanin (cathechic tannin), sedangkan terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan tanin (gallic tannin) (Kumoro, 2015).
5. Uji Kadar Steroid
Pengujian kadar steroid dilakukan dengan menghidrolisis lima gram partikel daun ketapang kering dengan 50 ml larutan asam klorida 0,5 N melalui proses
perebusan selama 30 menit. Campuran disaring dan filtrat yang diperoleh dipindahkan ke dalam corong pemisah. Etil asetat ditambahkan, kemudian dikocok dengan baik. Campuran dibiarkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan etil asetat (lapisan atas) diambil dan dikeringkan menggunakan oven pada suhu 100 oC selama 10 menit. Ekstrak kering yang diperoleh ditambahkan amil alkohol pekat dan dipanaskan untuk mengekstrak steroid. Campuran selanjutnya disaring menggunakan kertas saring yang telah ditimbang beratnya. Ekstrak dan kertas saring dikeringkan, lalu didinginkan, dan ditimbang bobotnya (Kumoro, 2015).
6. Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi n-Heksana
Pengujian aktivitas antioksidan fraksi n-heksana daun gugur ketapang diuji menggunakan metode DPPH dengan mengacu metode yang dilakukan oleh Marinova dan Batchvarov (2011) disertai beberapa modifikasi.
a. Pembuatan Larutan DPPH
Larutan DPPH 0,06 mM dibuat dengan menimbang 2,4 mg DPPH dan dilarutkan dalam 100 ml etanol p.a.
b. Optimasi Panjang Gelombang DPPH
Larutan DPPH 0,06 mM ditentukan nilai absorbansinya menggunakan spektofotometer
UV-Vis pada panjang gelombang 505-530 nm. Sehingga diperoleh panjang gelombang optimumnya dari nilai absorbansi tertinggi.
c. Pembuatan Larutan Uji
Sebanyak 1 mg fraksi n-heksana ditimbang lalu dilarutkan dalam 10 ml etanol p.a. Kocok hingga homogen, sehingga diperoleh larutan berkonsentrasi 100 ยตg/ml (larutan induk). Larutan induk diencerkan untuk membuat larutan uji dengan variasi konsentrasi 0,5 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 8 ppm dan 10 ppm.
d. Pengujian Larutan Uji
1,5 ml larutan DPPH 0,06 mM ditambahkan dalam 1,5 ml larutan ekstrak, lalu kocok hingga homogen. Campuran didiamkan selama 30 menit di ruang gelap pada suhu ruang. Nilai absorbansinya diukur pada panjang gelombang optimum.
e. Pengujian Larutan Pembanding 1) Asam Askorbat
Sebanyak 1 mg asam askorbat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 10 ml etanol p.a. lalu kocok hingga homogen, sehingga diperoleh larutan berkonsentrasi 100 ยตg/ml (larutan induk).
Larutan induk diencerkan untuk membuat larutan
berkonsentrasi 0,03125 ppm, 0,0625 ppm, 0,125 ppm, 0,25 ppm, 0,5 ppm, dan 1 ppm.
1,5 ml larutan DPPH 0,06 mM ditambahkan 1,5 ml larutan asam askorbat, lalu dikocok hingga homogen. Diamkan campuran selama 30 menit di ruang gelap pada suhu ruang. Nilai absorbansinya diukur pada panjang gelombang optimum.
2) Kuersetin
Sebanyak 1 mg kuersetin ditimbang lalu dilarutkan dalam 10 ml etanol p.a. lalu kocok hingga homogen, sehingga diperoleh larutan berkonsentrasi 100 ยตg/ml (larutan induk).
Larutan induk diencerkan untuk membuat larutan berkonsentrasi 0,03125 ppm, 0,0625 ppm, 0,125 ppm, 0,25 ppm, 0,5 ppm, dan 1 ppm.
1,5 ml larutan DPPH 0,06 mM ditambahkan 1,5 ml larutan kuersetin, lalu dikocok hingga homogen. Diamkan campuran selama 30 menit di ruang gelap pada suhu ruang. Nilai absorbansinya diukur pada panjang gelombang optimum.
G. Analisis Data
1. Pengukuran Persentase Rendemen Ekstrak
% Rendemen = ๐๐๐ ๐ ๐ ๐๐๐ ๐ก๐๐๐
๐๐๐ ๐ ๐ ๐ ๐๐๐๐๐ (๐) x 100%
2. Pengukuran Persentase Kadar Steroid
% Rendemen = ๐๐๐ ๐ ๐ ๐๐๐ ๐ก๐๐๐ (๐)
๐๐๐ ๐ ๐ ๐ ๐๐๐๐๐๐ ๐๐ ๐๐๐๐๐๐ (๐) x 100%
3. Aktivitas Antioksidan
a. Persentase Aktivitas Penghambatan Radikal Bebas DPPH
% I = ( ๐ด๐โ ๐ด๐
๐ด๐ ) x 100%
Keterangan:
% I = Persentase penghambatan radikal bebas (%) Ac = Nilai absorbansi kontrol (cm-)
As = Nilai absorbansi sampel uji (cm-) (Vasic et al., 2012)
b. Penentuan Konsentrasi Penghambatan 50% (IC50) Konsentrasi penghambatan 50% (IC50) diperoleh dari mengeplotan konsentrasi sampel (sumbu x) dan persentase penghambatan radikal bebas (sumbu y) melalui persamaan regresi linear.
Bentuk persamaannya adalah:
๐ฆ = ๐๐ฅ + ๐
Nilai konsentrasi IC50 (mg/L) sebagai nilai x dan nilai y sebagai persentase aktivitas antioksidan (% inhibisi). Nilai IC50 diperoleh dari perhitungan saat aktivitas antioksidan sebesar 50% pada persamaan garis linier. Adapun nilai a dan b
diperoleh melalui penggambaran kurva x terhadap y (Huliselan et al., 2015).
BAB IV
DESKRIPSI DAN ANALISIS DATA
A. Deskripsi Data
1. Penyiapan Simplisia
Simplisia yang digunakan pada penelitian ini yaitu serbuk daun gugur ketapang (Terminalia catappa L.) kering sebanyak 1000 gram.
2. Ekstraksi
Ekstrak kental etanol yang diperoleh dari proses maserasi daun gugur ketapang sebanyak 109,32 gram dengan rendemen 10,932%. Selanjutnya ekstrak etanol difraksinasi dengan n-heksana melalui proses fraksinasi cair-cair. Fraksi kental n-heksana yang diperoleh yaitu 2,22 gram dengan rendemen 2,13%.
3. Penapisan Fitokimia
Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa senyawa metabolit sekunder yang teridentifikasi pada fraksi n-heksana daun gugur ketapang yaitu steroid.
Hasil penapisan fitokimia ditunjukkan pada tabel 4.1.