METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
3.5 Rancangan Penelitian
3.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Deksametason
Larutan induk deksametason dibuat dengan menimbang secara seksama serbuk deksametason BPFI sebanyak 50 mg, kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol di dalam labu tentukur 50 mL dan dicukupkan dengan pelarut yang sama sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 1000 mcg/mL (LIB I). Selanjutnya diambil 10 mL larutan LIB I untuk diencerkan dengan di dalam labu tentukur 100 mL untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi 100 mcg/mL (LIB II).
3.5.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Deksklorfeniramin maleat
Dibuat larutan induk deksklorfeniramin maleat dengan melarutkan 50 mg serbuk deksklorfeniramin maleat baku dalam labu tentukur 50 mL dengan pelarut metanol dan dicukupkan sampai tanda batas untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi 1000 mcg/mL (LIB I). Kemudian diambil 10 mL dari LIB I untuk diencerkan dengan metanol di dalam labu tentukur 100 mL sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 100 mcg/mL (LIB II).
3.5.3 Pembuatan Larutan Standar Deksametason
Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 10 mL yang memiliki konsentrasi masing-masing 5 mcg/mL, 8 mcg/mL, 10 mcg/mL, 13 mcg/mL, dan 15 mcg/mL, dengan cara mengencerkan sebanyak 0,5 mL; 0,8 mL; 1,0 mL; 1,3 mL; dan 1,5 mL secara berurutan dari LIB II deksametason menggunakan pelarut metanol.
21
3.5.4 Pembuatan Larutan Standar Deksklorfeniramin maleat
Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 10 mL yang memiliki konsentrasi masing-masing 8 mcg/mL, 10 mcg/mL, 12 mcg/mL, 15 mcg/mL, dan 20 mcg/mL, dengan cara mengencerkan sebanyak 0,8 mL; 1,0 mL; 1,2 mL; 1,5 mL; dan 2,0 mL dari LIB II deksklorfeniramin maleat.
3.5.5 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Deksametason
Diambil sebanyak 1,1 mL dari LIB II deksametason (konsentrasi = 100 mcg/mL) kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 mL untuk diencerkan dengan pelarut metanol hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan deksametason dengan konsentras 11 mcg/mL. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.5.6 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Deksklorfeniramin maleat Diambil sebanyak 1,6 mL dari LIB II deksklorfeniramin maleat (konsentrasi = 100 mcg/mL) kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL untuk diencerkan dengan pelarut metanol hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 16 mcg/mL. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm.
22 3.5.7 Pembuatan Spektrum Serapan Derivat
Dibuat larutan deksametason dengan konsentrasi 5 mcg/mL dan deksklorfeniramin maleat 20 mcg/mL. Kemudian dibuat spektrum serapan pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.5.8 Penentuan Zero Crossing
Penentuan zero crossing diperoleh dengan mentumpangtindihkan spektrum serapan dari deksametason (5 mcg/mL) dan deksklorfeniramin maleat (20 mcg/mL) pada masing-masing derivat. Zero crossing masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol pada konsentrasi tersebut.
3.5.9 Penentuan Panjang Gelombang Analisis
Dibuat larutan deksametason dengan konsentrasi 5 mcg/mL, deksklorfeniramin maleat dengan konsentrasi 20 mcg/mL, dan larutan campuran kedua zat itu sehingga di dalamnya terdapat deksametason dengan konsentrasi 5 mcg/mL dan deksklorfeniramin maleat dengan konsentrasi 20 mcg/mL. Spektrum serapan derivat kedua dari deksametason 5 mcg/mL, deksklorfeniramin maleat 20 mcg/mL dan campuran deksametason 5 mcg/mL dan deksklorfeniramin maleat 20 mcg/mL ditumpangtindihkan. Pemilihan untuk menjadi panjang gelombang analisis adalah pada saat serapan senyawa pasangannya nol dan serapan maksimum zat itu dan campurannya hampir sama atau persis sama, karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara selektif mengukur serapan zat tersebut.
23
3.5.10 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Deksametason Dipipet LIB II deksametason sebanyak 0,5 mL; 0,8 mL; 1,0 mL; 1,3 mL ; dan 1,5 mL. Masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, diencerkan dengan metanol hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 5 mcg/mL; 8 mcg/mL; 10 mcg/mL; 13 mcg/mL; dan 15 mcg/mL. Kemudian diukur serapan pada derivat kedua (∆λ = 2 nm) pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dengan serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b, dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan batas deteksi / Limit of Detection (LOD) dan batas kuantitasi / Limit of Quantitation (LOQ). Untuk menentukan LOD dan LOQ dapat digunakan rumus : SB =�∑(y-yi)2 n-2 LOD= 3 × SB Slope LOQ= 10 × SB Slope Keterangan : SB = simpangan baku LOD = limit of detection LOQ = limit of quantitation
24
3.5.11 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Spektrum Kalibrasi Deksklorfeniramin Maleat
Dipipet LIB II dekslorfeniramin maleat sebanyak 0,8 mL; 1,0 mL; 1,2 mL; 1,5 mL; dan 2,0 mL. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 mL, diencerkan dengan metanol hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 8,0 mcg/mL; 10,0 mcg/mL; 12,0 mcg/mL; 15,0 mcg/mL; dan 20,0 mcg/mL. Kemudian diukur serapan pada derivat kedua (∆λ= 2 nm) pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dengan nilai serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan batas deteksi / Limit of
Detection (LOD) dan batas kuantitasi / Limit of Quantitation (LOQ). Perhitungan
menentukan batas deteksi dan batas kuantitasi seperti rumus di atas.
3.5.12 Penentuan Kadar Deksametason dan Deksklorfeniramin Maleat dalam Sediaan Tablet
Dua puluh tablet yang mengandung deksametason 0,5 mg dan deksklorfeniramin maleat 2 mg ditimbang, digerus dalam lumpang sampai halus dan homogen. Kemudian ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 2 mg deksklorfeniramin maleat (penimbangan serbuk sebanyak enam kali pengulangan), dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, ditambahkan metanol sampai garis tanda sambil dikocok. Larutan kemudian dihomogenkan dengan pengaduk ultrasonik selama 15 menit. Larutan tersebut kemudian disaring, sebagian filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung. Kemudian dari larutan filtrat ini, dipipet 1 mL dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL dan diencerkan
25
dengan metanol hingga garis tanda (konsentrasi 20 mcg/mL untuk deksklorfeniramin maleat dan konsentrasi 5 mcg/mL untuk deksametason). Larutan diukur serapannya pada derivat kedua pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan untuk deksklorfeniramin maleat dan deksametason.
3.5.13 Uji Validasi 3.5.13.1 Uji Akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan baku , yaitu dengan membuat tiga konsentrasi analit sampel dengan rentang spesifik 80%, 100%, 120%, dimana masing-masing dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan. Setiap rentang spesifik mengandung 70% analit dan 30% baku pembanding, kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada penetapan kadar sampel (Harmita,2004).
Menurut Harmita (2004), persen perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% perolehan kembali = A-B
C × 100%
Keterangan :
A = konsentrasi zat yang diperoleh setelah penambahan baku B = konsentrasi zat sebelum penambahan bahan baku
C = konsentrasi baku yang ditambahkan
3.5.13.2 Uji Presisi
Menurut Rohman (2007), uji presisi (keseksamaan) ditentukan dengan parameter RSD dengan rumus :
RSD = SD
26
Menurut Rohman (2007), untuk menghitung Standard Deviation (SD) digunakan rumus : SD =
( )
1 -n X -Xi 2∑
Keterangan :RSD = relative standard deviation SD = standard deviation
X = kadar rata-rata deksametason atau deksklorfeniramin maleat dalam tablet
3.5.14 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar deksametason dan deksklorfeniramin maleat dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji t.
Menurut Sudjana (2005) rumus yang digunakan adalah :
SD =
( )
1 -n X -Xi 2∑
Untuk mencari t hitung digunakan rumus:
t hitung = SD n
X Xi
/
−
Data diterima jika -ttabel < thitung < ttabel pada interval kepercayaan 99%
dengan nilai α = 0,01. Keterangan :
SD = standard deviation
Xi = kadar dalam satu perlakuan X = kadar rata-rata dalam satu tablet
27 n = jumlah pengulangan
α = tingkat kepercayaan
Untuk menghitung kadar deksametason dan deksklorfeniramin maleat dalam sampel secara statistik menggunakan rumus :
μ = X ± (t1-1/2 α, dk) x SD / √n) Keterangan :
µ = interval kepercayaan
X = kadar rata-rata tablet X = kadar sampel
t = harga ttabel sesuai dengan dk = n-1
α = tingkat kepercayaaan dk = derajat kebebasan SD = standard deviation n = jumlah pengulangan
28 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN