BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.9. Rancangan Percobaan
3.9.1. Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi menurut Materia Medika Indonesia jilid V. 3.9.1.1. Asam klorida 2 N
Sebanyak 20 ml HCl(p) diencerkan dengan air suling sampai 100 ml. 3.9.1.2. Besi (III) klorida 10% b/v
Sebanyak 10 g FeCl3 dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml. 3.9.1.3.Natrium hidroksida
Sebanyak 8 gram kristal NaOH dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml 3.9.1.4.Timbal (II) asetat
Sebanyak 15,17gram kristal timbal (II) asetat dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml
3.9.1.5.Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 gram kalium iodide dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambahkan 2 gram iodium sambil diaduk sampai larut, lalu ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.9.1.6.Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 gram bismuth nitrat dilarutkan dalam asam nitrat 20 ml kemudian dicampur dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 gram dalam 50 ml air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml.
3.9.1.7.Pereaksi Mayer
Sebanyak 5 gram kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air suling kemudian ditambahkan larutan 1,36 gram merkuri (II) klorida dalam 60 ml air suling. Larutan dikocok dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.9.1.8.Pereaksi Molish
Sebanyak 3 gram α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5N secukupnya hingga 100 ml.
3.9.2. Penyiapan Bahan
Penyiapan bahan meliputi determinasi tumbuhan, pengumpulan bahan dan pembuatan simplisia.
3.9.2.1.Determinasi Tumbuhan
Determinasi tumbuhan dilakukan oleh Laboratorium Taksonomi Tumbuhan FMIPA USU.
3.9.2.2.Pengumpulan Bahan
Sampel yang digunakan adalah daun pepaya yang biasa dikonsumsi oleh masyarakat sebagai bahan baku sayuran. Sampel diambil dari kebun pepaya di Medan. Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tempat tumbuh di daerah lain.
3.9.3 Pembuatan Simplisia
Daun pepaya dibersihkan dari kotoran, dicuci dengan air bersih, ditiriskan. Daun dikering anginkan tanpa terkena cahaya matahari. Simplisia yang diperoleh diserbuk dengan blender dan disimpan dalam wadah yang sesuai.
31
3.9.3.1. Pemeriksaan Pendahuluan Kandungan Kimia Serbuk Simplisia Dilakukan pemeriksaan golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tannin, steroid.
3.9.3.1.1. Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 500 mg serbuk simplisia ditambahkan 1 ml HCl 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut:
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam.
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dengan 2 atau 3 percobaan diatas.
3.9.3.1.2. Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 gram serbuk simplisia disari dengan 30 ml etanol 95% dan air suling (7:3) dan 10 ml asam sulfat 2 N, lalu direfluks selama 1 jam. Didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambah dan didiamkan selama 5 menit, disaring. Filtrat disari tiga kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 bagian isopropanol. Kumpulan sari air diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50 0C. Sisa dilarutkan dengan 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan ke tabung reaksi, selanjutnya diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5
tetes larutan pereaksi Molish. Ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, akan terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida.
3.9.3.1.3. Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 gram serbuk dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 1 cm sampai 10 cm yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, menunjukkan adanya saponin. 3.9.3.1.4. Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 0,5 g serbuk direfluks dengan 10 ml metanol selama 10 menit, kemudian disaring. Filtratnya diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, dan didiamkan. Lapisan metanol diambil, lalu diuapkan pada suhu 40 0C, sisanya dilarutkan dalam 1 ml etanol, kemudian ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 10 ml asam klorida pekat, jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoida.
3.9.3.1.5. Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 500 mg sampel disari dengan 10 ml air, disaring, lalu diencerkan sampai hampir tidak berwarna. Kepada 2 ml larutan sampel ditambahkan 1-2 tetes larutan FeCl3 10 % dan diperhatikan warna yang terjadi, warna biru, biru-hitam, hijau atau biru-hijau dan endapan menunjukkan adanya tanin.
3.9.3.1.6. Pemeriksaan Steroida
Sejumlah 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring. Filtrat digunakan untuk reaksi berikut: 5 ml larutan eter diuapkan di
33
dalam cawan penguap, ke dalam sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat(p). reaksi steroida positif bila terjadi warna merah-ungu atau biru-hijau.
3.9.4. Pembuatan Ekstrak Metanol dan n-Heksana 3.9.4.1. Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Pepaya
Sebanyak 1000 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibasahi dengan sejumlah cairan penyari metanol, dimaserasi selama 48 jam. Cairan disaring hingga diperoleh cairan berwarna, diulangi hingga tiga kali. Maserat dirotavapor hingga menjadi ekstrak agak pekat, selanjutnya metanol diuapkan hingga tidak bersisa. Hasil akhir berupa ekstrak pekat. Untuk penggunaan pada hewan coba, ekstrak pekat dikeringkan hingga membentuk serbuk.
3.9.4.2. Pembuatan Ekstrak n-Heksana Daun Pepaya
Sebanyak 1000 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibasahi dengan sejumlah cairan penyari n-heksana, dimaserasi selama 48 jam. Cairan disaring hingga diperoleh cairan berwarna, diulangi hingga tiga kali. Maserat dirotavapor hingga menjadi ekstrak agak pekat, selanjutnya n-heksana diuapkan hingga tidak bersisa. Hasil akhir berupa ekstrak pekat. Untuk penggunaan pada hewan coba, ekstrak pekat dikeringkan hingga membentuk serbuk.
Diuapkan metanol/n-heksana dengan penangas air
3.9.5. Penyiapan Bahan Uji, Kontrol, dan Obat Pembanding
Ekstrak metanol dan n-heksana daun pepaya dibuat dalam bentuk suspensi menggunakan CMC 1 %. Obat pembanding indomethacin dibuat dalam bentuk suspensi menggunakan CMC 1% dengan dosis 5 mg/kg BB. Kontrol yang digunakan adalah suspensi CMC 1% dalam air suling.
3.9.6. Penyiapan Induktor Radang
Dibuat karagenan 1 % dalam air suling kemudian diaktifkan dengan cara menginkubasinya pada suhu 37 0C selama 24 jam.
1000 gram daun pepaya
Ekstrak metanol / n-heksana
Ekstrak metanol / n-heksana sedikit pekat
Residu Dicuci, dikeringkan, diserbuk
Dimaserasi dengan metanol / n-heksana selama 48 jam (diulangi 3x)
Diskrining fitokimia Dirotavapor
Gambar 3.1. Diagram proses pembuatan ekstrak metanol dan n-heksana daun pepaya Ekstrak pekat metanol / n-heksana
35
3.9.7. Persiapan Hewan Coba
Dua minggu sebelum pengujian, hewan percobaan dipelihara pada kandang yang mempunyai ventilasi yang baik dan selalu dijaga kebersihannya. Hewan yang sehat ditandai dengan kenaikan berat badan yang teratur dan memperlihatkan gerakan yang lincah.
3.9.8. Prosedur Pengujian Antiinflamasi 3.9.8.1. Penelitian inflamasi akut
Pada hari pengujian, masing-masing hewan ditimbang. Sebelum perlakuan, diambil darah dari pangkal ekor tikus, kenudian dilakukan pemeriksaan jumlah leukosit dengan alat Haemocytometer dan pemeriksaan hitung jenis leukosit. Kemudian pada masing-masing kelompok (P0-P5) diberikan perlakuan seperti tabel di bawah ini.
Tabel 3.1. Perlakuan hewan coba pada percobaan inflamasi akut
No Kelompok Perlakuan Jumlah
1 Kelompok P0 Salin (per oral) 6
2 Kelompok P1 Indomethacin 10 mg/kgBB (per oral) 6 3 Kelompok P2 Ekstrak metanol daun pepaya dosis I (250 mg/kg) 6 4 Kelompok P3 Ekstrak metanol daun pepaya dosis II(500mg/kg) 6 5 Kelompok P4 Ekstrak n heksana daun pepaya dosis I(250 mg/kg) 6 6 Kelompok P5 Ekstrak n heksana daun pepaya dosis II(500mg/kg) 6
Satu jam kemudian masing-masing telapak kaki tikus disuntik secara intraplantar dengan metode subkutan dengan 0,1 ml larutan karagenan 1 %
subkutan. Setelah 3 jam dan enam jam dari penyuntikan karagenan diambil lagi dari pangkal ekor tikus, kenudian dilakukan pemeriksaan jumlah leukosit dengan alat Haemocytometer dan pemeriksaan hitung jenis leukosit.
Secara skematis alur prosedur penelitian digambarkan sebagai berikut:
Gambar 3.2. Alur Prosedur Penelitian
37
3.10. Prosedur Pemeriksaan Jumlah Leukosit