3.2 Bahan dan Alat
3.3.1 Reidentifikasi Vaksin AI H5N1
Vaksin AI H5N1 inaktif strain Legok diekstraksi dengan menggunakan pelarut lemak (kloroform atau eter, disentrifugasi kemudian endapannya diambil untuk uji
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) (Ditjennak 2007).
Isolasi RNA dilakukan dengan menggunakan metoda TRIZOLR LS Reagent (Invitrogen) sebagai berikut : sebanyak 250 μl vaksin dan 750 μl Trizol dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1.8 ml, kemudian dihomogenkan memakai vortex mixer. Larutan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar (25–30o C), kemudian ditambahkan 500 μl chloroform. Tabung tersebut dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8o C selama 15 menit. Sebanyak 500 μl fase cair pada supernatan (putih bening) diambil dan dimasukkan kedalam tabung baru. Fase cair tersebut ditambahkan 500 μl
isoprophil alcohol dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8o C selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalam endapan tersebut ditambahkan 1000 μl ethanol 75% dan disentrifus dengan kecepatan12.000 g selama 5 menit. Endapan RNA dikeringkan selama 7 menit di dalam laminar air flow, selanjutnya dilarutkan dengan 10 μl air suling bebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalah larutan RNA diinkubasikan dalam penangas air 60o C selama 10 menit. Larutan RNA di simpan pada suhu – 20o C sampai dilakukan RT-PCR.
Reverse transcription adalah pembuatan cDNA yang bersifat komplementer
dengan RNA virus, menggunakan enzim reverse transcriptase. Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dilakukan dengan metoda Super ScriptTM III One- Step RT-PCR System with Platinum R Taq DNA Polymerase (Invitrogen). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen H5 adalah menurut Lee dan Suarez (2004) dan primer N1 (Tabel 4). Reaksi PCR (PCR mix) dibuat sebanyak 50 µl dengan komposisi sebagai berikut : 25 l 2x reaction PCR mix , 2 l Platinum Taq, 5 l RNA template, 1 l
Primer forward (10 µM), 1 l Primer reverse (10 µM) dan 16 l ddH2O (ultrapure H2O). Campuran tersebut dihomogenkan dengan vortex mixer, kemudian dimasukkan ke dalam mesin thermocycle yang telah diprogram. Program RT-PCR adalah menurut Lee et al.
2001: cDNA synthesis 60o C selama 30 menit, predenaturasi 95o C selama 2 menit, selanjutnya 35 siklus terdiri dari denaturasi 95o C selama 40 detik, penempelan 50o–55o C selama 40 detik, ekstensi 72o C selama 1 menit dan post ekstensi 72o C selama 4 menit. Pita DNA spesifik hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis pada gel agarose 2 %.
Tabel 4 Primer Untuk mengamplifikasi Virus AI H5N1
___________________________________________________________________ Primer Sekuen basa Produk (pb) ___________________________________________________________________
1 H5N1-H5-forward: 5’AAA CAG AGA GGA AAT AAG TTG AAAA ATT’3 55 H5N1-H5-reverse: 5’AAA GAT AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC’3
2 H5N1-N1-forward GD: 5'- TTG CTT GGT C(A/G)G CAA GTG C 120 H5N1-N1-reverse Yong: 5'- TGA T(A/G)G TGT CTG TTA TTA TGC C
____________________________________________________________________
pb: pasangan basa
Elektroforesis produk amplifikasi PCR (DNA) dilakukan menggunakan ultrapure
agarose (Invitrogen) 2%. Sebanyak 2 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE
buffer, kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi jernih. Ethium bromide ditambahkan ke dalam gel hangat selanjutnya gel dituangkan ke dalam dish mupid (sebanyak 50 ml kedalam dish yang besar) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit. Sambil menunggu, sebanyak 250 ml TBE buffer dituangkan ke dalam
mupid electrophoresis. Gel yang beku diletakkan di dalam mupid elektroforesis dengan aliran listrik negatif mengalir ke positif. Sebanyak 2 μl loading dye (BlueJuice Gel Loading-Invitrogen) dan 8 μl produk amplifikasi PCR dicampur dan dimasukkan ke dalam lubang gel. Voltase yang digunakan sebesar 50 Volt selama 45 menit. Pita atau fragmen DNA yang teramplifikasi dilihat dibawah sinar ultaviolet.
3.3.2 Produksi Antibodi Poliklonal Avian Influenza H5N1 (Ab1)
Produksi antibodi poliklonal AI H5N1 dilakukan pada 10 ekor marmut dengan berat badan 350-400 gram. Darah preimunisasi diambil untuk mengetahui titer antibodi terhadap virus AI H5N1. Imunisasi dilakukan dengan menyuntik satu dosis vaksin AI
H5N1 inaktif strain Legok (0,5 ml) secara subkutan. Penyuntikan diulang sebanyak 3 kali dengan interval 3 minggu. Keberadaan antibodi dideteksi dengan uji hambatan hemaglutinasi (Hemaglutination Inhibition/HI) (WHO 2002, OIE 2005) dan uji agar gel presipitasi (Agar Gel Precipitationt/AGP). Serum dikoleksi setelah titer antibodi tinggi dalam darah yaitu seminggu setelah imunisasi ke-3.
3.3.2.1 Reidentifikasi Serum Anti AI H5N1 (Ab1)
Reidentifikasi serum marmut dilakukan dengan uji HI dan uji AGP (OIE 2005). Serum marmut diinaktifasi terlebih dahulu dalam penangas air 56o C selama 30 menit dan diabsorbsi dengan sel darah merah ayam pada suhu ruang selama 30 menit, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 1000 g selama 5 menit dan diambil supernatannya untuk selanjutnya di uji HI. Uji hambatan hemaglutinasi adalah sebagai berikut: pada semua lubang microplate 96 lubang dimasukkan pengencer PBS dan pada lubang pertama dimasukkan 25 µl serum. Pengenceran secara seri kelipatan dua sampai dengan lubang 11, selanjutnya ditambahkan sebanyak 25 µl antigen AI H5N1 4 HAU/25 µl. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian ditambahkan sel darah merah ayam SPF 1% sebanyak 25 µl pada semua lubang dan selanjutnya diinkubasikan pada suhu kamar selama 40 menit. Titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi serum yang mampu menghambat aglutinasi sel darah merah.
Uji agar gel presipitasi adalah sebagai berikut: agar gel dibuat dengan melarutkan 0.4 g agarose dan 1.2 g Poly Ethylene Glycol (PEG) 6000, 0.1% Na azide dalam 25 ml PBS pH 7.4 dan 25 ml akuades pH 7.4. Larutan ini dipanaskan dalam microwave sampai larut dan warna larutan menjadi bening. Larutan sebanyak 3.75 ml dituangkan pada gelas obyek dan ditunggu sampai mengeras, kemudian dibuat sumur-sumur dengan puncher. Antigen sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur tengah dan antibodi sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur disekelilingnya.
3.3.2.2 Pemurnian Imunoglobulin G Anti AI H5N1 (Ab1)
Pemurnian Imunoglobulin G (IgG) AI H5N1 dari serum marmut (Ab1) dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit & spin column with Prosep A
media (Millipore). Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian dimasukkan kedalam spin colomn. Spin column dicuci dengan 10 ml binding buffer, kemudian disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum marmut di saring dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 µm, selanjutnya sampel serum dilarutkan dengan binding buffer dengan perbandingan 1:1 v/v, lalu dimasukkan kedalam spin column dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Spin colomn dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer dan elusi dilakukan langsung kedalam tabung sentrifus yang berisi 1,3 ml buffer netral, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada dibawah ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG poliklonal.
Reidentifikasi IgG AI H5N1 dilakukan dengan uji AGP dan untuk mengetahui berat molekul IgG dilakukan SDS-PAGE (Hames & Rickwood 1987) dengan menggunakan sistem diskontinyu. Sistem ini terdiri atas gel pemisah dengan konsentrasi 12 % dan gel pengumpul dengan konsentrasi 4 %. Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi berat molekul protein berdasarkan perbandingan dengan marker umum berat molekul, selanjutnya konsentrasi IgG dihitung dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet.
3.3.2.3 Pemotongan Imunoglobulin G AI H5N1 dan Pemurnian Fragmen F(ab)2
Pemotongan Imunoglobulin G (IgG) dari serum marmut ditujukan untuk memperoleh fragmen F(ab)2 dari imunoglobulin. Fragmen F(ab)2, selanjutnya disebut Ab1,akan digunakan untuk merangsang terbentuknya antibodi spesifik terhadap epitop Ab1 pada kelinci. Antibodi yang akan terbentuk oleh Ab1 ini merupakan antibodi anti- idiotipe (Ab2). Pemotongan dilakukan dengan menggunakan enzim pepsin, sehingga akan diperoleh 1 fragmen F(ab)2 divalen yang mengandung 2 Fab dan 1 fragmen Fc.
Imunoglobulin G dibuat menjadi 5 mg/ml dalam Na sitrat 100 mM pH 3.5. Pemotongan IgG dilakukan dengan menggunakan 5 µg pepsin untuk 1 mg IgG, kemudian diinkubasi dalam penangas air pada suhu 37 0C selama 24 jam, setelah 24 jam reaksi pemotongan dihentikan dengan Tris buffer 3 M pH 8,8 sebanyak 10%, lalu disentrifus
dengan kecepatan 10.000 g selama 30 menit. Larutan ini kemudian di desalting dengan
Amicon Ultra 15 dengan kecepatan 4500 g selama 20 menit. Larutan ini kemudian di
dialisis dalam PBS pH 8.0 selama 24 jam untuk menghilangkan garam yang terdapat pada larutan protein. Proses dialisis ini akan menyebabkan molekul-molekul garam keluar melalui pori-pori tabung secara bertahap hingga konsentrasi garam di dalam dan di luar tabung dialisis menjadi sama. Hasil dialisis inilah yang akan digunakan sebagai Ab1 untuk mengimunisasi kelinci.
Reidentifikasi dilakukan dengan metode SDS-PAGE. Fragmen F(ab)2 memiliki berat molekul 110 kDa, selanjutnya konsentrasi ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet.