2 TINJAUAN PUSTAKA
Percobaan 2. Respon kalus tipe 1 durian terhadap konsentrasi BA pada media induksi embriogenesis somatik
Kalus tipe 1 dari percobaan 1 eksplan petal varietas Simas disubkultur ke media induksi dengan perlakuan konsentrasi BA 0.0, 0.3, 0.5, 1.0, dan 2.0 ppm. Komposisi media induksi adalah media dasar MS dengan vitamin media B5 yang dilengkapi dengan glutamina 100 ppm, asparagina 100 ppm, kasein hidrolisat 500 ppm, dan pikloram 0.5 ppm. Percobaan disusun dengan rancangan acak kelompok dengan 7 ulangan, tiap ulangan terdiri atas 4 botol. Pengamatan meliputi jumlah kalus embriogenik dan jumlah embrio somatik yang terbentuk serta persentase pertambahan ukuran luas kalus yang dihitung dengan rumus:
Persentase pertambahan luas kalus = x 100% Luas kalus diukur menggunakan plastik transparan milimeter block. Plastik milimeter block dipasang pada bagian bawah botol kemudian dipotret dengan kamera. Ukuran luas kalus ditentukan dengan menghitung petak milimeter yang terdapat pada gambar kalus.
Luas kalus akhir – luas kalus awal Luas kalus awal
Gambar 4 Kondisi kalus penampakan langsung dan mikroskopis. a: kalus tipe 1; b: pengamatan mikroskopis dari kalus tipe 1; c: kalus tipe 2; d: pengamatan mikroskopis dari kalus tipe 2; e: kalus tipe 3; f: pengamatan mikroskopis dari kalus tipe 3; g: kalus tipe 4, merupakan kalus embriogenik dan muncul embrio somatik
c d g 5 mm 2 a b 5 mm e f
Analisis Data
Data variabel persentase eksplan berkalus, waktu muncul kalus dan pertambahan ukuran kalus dianalisis dengan analisis ragam dan dilanjutkan dengan uji DMRT (Duncan Multiple Range Test) untuk faktor perlakuan yang berpengaruh nyata. Data skor tipe kalus (merupakan karakter kualitatif yang frekwensinya dihitung) dianalisis dengan Chi kuadrat dan Tabel Kontingensi. Data skor ukuran kalus dianalisis dengan uji Kruskal-Wallis (Zarr 2010).
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Induksi Kalus Embriogenik Durian dari Berbagai Eksplan pada Berbagai Komposisi Media
Induksi kalus embriogenik dari eksplan dasar bunga Waktu muncul kalus
Analisis ragam pengaruh komposisi media dan genotipe terhadap kecepatan muncul kalus eksplan dasar bunga durian menunjukkan bahwa faktor genotipe (Tabel 11), komposisi media (Tabel 12) dan interaksi genotipe-komposisi media berpengaruh sangat nyata terhadap kecepatan muncul kalus eksplan dasar bunga. Komposisi media yang menghasilkan waktu muncul kalus yang cepat bervariasi antar genotipe. Waktu muncul kalus eksplan dasar bunga varietas Matahari dan aksesi Dramaga lebih cepat daripada varietas Simas.
Persentase eksplan berkalus
Persentase eksplan berkalus pada eksplan dasar bunga dipengaruhi oleh faktor komposisi media (Tabel 12), sementara faktor genotipe (Tabel 11) dan interaksi genotipe-komposisi media tidak berpengaruh nyata. Komposisi media yang mengandung ZPT NAA 2 sampai 6 ppm menghasilkan kalus dengan persentase 90.9 sampai 97.5 persen, sedangkan media yang mengandung ZPT pikloram 2 sampai 6 ppm menghasilkan kalus dengan persentase 65.8 sampai 77.1 persen (Tabel 12).
Tabel 11 Pengaruh genotipe terhadap waktu muncul kalus dan persentase eksplan berkalus pada eksplan dasar bunga
Genotipe Waktu muncul kalus (HST) Eksplan berkalus (%) Dramaga 4.49 b 80.46 Matahari 4.69 b 89.19 Simas 11.65 a 86.23
Keterangan : Angka-angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji DMRT
Tabel 12 Pengaruh komposisi media terhadap persentase eksplan berkalus, waktu muncul kalus, tipe kalus dan skor ukuran kalus pada eksplan dasar bunga durian
Komposisi Media
Eksplan berkalus
(%)
Waktu muncul kalus (HST) Proporsi (%) tipe kalus pada genotipe : Skor ukuran kalus
Dramaga Matahari Simas Dramaga Matahari Simas
Dramaga Matahari Simas Tipe 1 Tipe 2 Tipe 1 Tipe 2 Tipe 1 Tipe 2 Md Z Md Z Md Z
B5 tanpa ZPT 91.3 abc 4.2 c(A) 6.3(A) - 95.7 4.4 100.0 0 - - 1 -2.40 4 -0.06 - -
B5 + NAA 2 ppm 96.3 ab 4.2 c(B) 3.8(B) 9.1 cd(A) 88.7 11.3 100.0 0 82.6 17.4 2 3.12 5 1.04 3 -0.70
B5 + NAA 4 ppm 94.1 ab 4.0 c(B) 5.0(B) 9.6 cd(A) 80.9 19.2 100.0 0 86.4 13.6 3 5.40 4 -0.01 5 1.02
B5 + NAA 6 ppm 97.5 a 4.0 c(B) 4.0(B) 8.1 cd(A) 84.0 16 100.0 0 83.3 16.7 3 3.58 4 0.68 3.5 -0.46
B5 + pikloram 2 ppm 67.9 d 5.9 a(B) 4.8(B) 17.0 ab(A) 94.4 5.6 100.0 0 88.9 11.1 1 -2.81 3 -0.23 4.5 -0.2
B5 + pikloram 4 ppm 73.7 cd 6.4 a(B) 5.7(B) 11.0 cd(A) 78.4 21.6 100.0 0 95.7 4.3 1 -1.11 4 0.17 5 3.99
B5 + pikloram 6 ppm 70.8 d 6.1 a(B) 3.8(B) 9.8 cd(A) 85.7 14.3 100.0 0 100.0 0 2 -0.57 4.5 1.28 5 0.30
MS tanpa ZPT 79.7 abcd 5.0 b(A) 4.6(A) - 95.0 5.0 100.0 0 - - 3 3.29 4 -0.08 - -
MS + NAA 2 ppm 91.8 abc 3.9 c(B) 4.7(B) 7.35 d(A) 86.4 13.6 100.0 0 100.0 0 2 2.52 3.5 -0.22 4 0.77
MS + NAA 4 ppm 90.9 abc 3.8 c(B) 4.6(B) 9.18 cd(A) 83.3 16.7 100.0 0 100.0 0 2 2.18 4 -0.08 4 -0.04
MS + NAA 6 ppm 91.9 abc 3.9 c(B) 5.4(B) 13.18 cb(A) 89.8 10.2 100.0 0 100.0 0 1 -1.53 3 -1.63 5 0.32
MS + pikloram 2 ppm 73.8 cd 4.5 bc(B) 4.0(B) 20.12 a(A) 66.7 33.3 100.0 0 100.0 0 1 -5.41 3.5 -0.44 3 -1.4
MS + pikloram 4 ppm 77.1 bcd 4.1 c(B) 6.0(B) 17.12 ab(A) 45.9 54.1 85.7 14.3 94.1 5.9 1 -4.44 2 -1.32 3 0.08
MS + pikloram 6 ppm 65.8 d 4.0c(B) 2.8(B) 13.05 cb(A) 57.1 42.9 100.0 0 100.0 0 1 -4.34 4 1.19 1 -3.95
P-value 0.00 0.00 0.28 0.00 0.00 0.84 0.34 0.00 0.74 0.00
Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf kecil yang sama pada kolom yang sama dan angka-angka yang diikuti huruf besar yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata pada uji DMRT (α = 0.05). Tipe 1: Kalus kompak, warna agak putih keruh sampai agak kekuningan; Tipe 2: Kalus kompak, warna putih bersih seperti kapas; -: data tidak tersedia. Skor 1: < 25%; skor 2: 25-50%; skor 3: 50-75%; skor 4: 75-100%; skor 5: > 100%. Md: nilai median skor ukuran kalus per perlakuan; Z: normal baku dari rerata ranking skor ukuran kalus pada tiap perlakuan.
Skor ukuran kalus
Analisis dengan uji Kruskal-Wallis pengaruh komposisi media terhadap skor ukuran kalus pada eksplan dasar bunga durian menunjukkan pengaruh komposisi media sangat nyata terhadap ukuran kalus pada aksesi Dramaga dan varietas Simas, sementara pada varietas Matahari tidak berpengaruh nyata. Kalus berukuran besar (skor 5) lebih banyak dijumpai pada varietas Simas (Tabel 12).
Tipe kalus
Kondisi kalus yang baru tumbuh dari eksplan dasar bunga merupakan kalus remah berair (kalus tipe 3, Gambar 4e, hal. 22) yang sel-selnya mudah dipisahkan satu sama lain dan pada pengamatan dengan mikroskop terlihat sel-sel yang berukuran relatif besar, berbentuk memanjang dan bulat, sitoplasma transparan, inti sel sangat kecil atau tidak terlihat (Gambar 4f hal. 22). Dalam satu sampai dua minggu setelah tumbuh kalus, kalus tipe 3 tersebut berkembang menjadi kalus tipe 1 atau kalus tipe 2, sehingga nilai pengamatan atas tipe kalus asal eksplan dasar bunga dibedakan menjadi tipe 1 dan tipe 2. Kalus tipe 1 berstruktur kompak keras berwarna agak putih keruh sampai agak kuning keruh. Pengamatan dengan mikroskop menunjukkan sel-sel dengan bentuk bervariasi, transparan dengan inti kecil atau tidak terlihat (Gambar 4a dan 4b hal. 22). Kalus tipe 2 berstruktur kompak berwarna putih bersih seperti kapas. Hasil pengamatan dengan mikroskop kalus tipe 2 mirip dengan kalus tipe 1 (Gambar 4c dan 4d hal. 22).
Analisis dengan Tabel Kontingensi dan Chi Kuadrat pengaruh komposisi media terhadap tipe kalus pada eksplan dasar bunga menunjukkan komposisi media berpengaruh nyata terhadap tipe kalus pada aksesi Dramaga, sementara pada varietas Simas dan Matahari tidak berpengaruh nyata. Media MS + pikloram 4 ppm menghasilkan kalus tipe 2 dengan persentase lebih tinggi daripada media lain pada aksesi Dramaga (Tabel 12).
Berdasarkan keempat variabel yang diamati pada eksplan dasar bunga, komposisi media terbaik pada induksi kalus dari eksplan dasar bunga adalah media dasar B5 dengan tambahan NAA 2 ppm. Media ini menghasilkan kalus dengan persentase tinggi (tidak berbeda nyata dengan rerata tertinggi), waktu muncul kalus yang cepat (tidak berbeda nyata dengan rerata tertinggi) pada semua genotipe, proporsi kalus tipe 1 yang relatif tinggi pada semua genotipe, dan ukuran kalus yang besar (nilai median skor 3 dari rentang 1 sampai 3 pada aksesi Dramaga, skor 4 dari rentang 1 sampai 5 pada varietas Matahari, dan skor 5 dari rentang 1 sampai 5 pada varietas Simas).
Induksi kalus embriogenik dari eksplan petal Waktu muncul kalus
Analisis ragam pengaruh komposisi media dan genotipe terhadap persentase eksplan berkalus pada eksplan petal menunjukkan bahwa faktor genotipe (Tabel 13) dan faktor komposisi media (Tabel 14) berpengaruh sangat nyata terhadap persentase eksplan petal berkalus sedangkan faktor interaksi
genotipe–media tidak berpengaruh nyata. Eksplan petal varietas Matahari menghasilkan kalus dengan persentase lebih tinggi daripada varietas Simas dan varietas Simas menghasilkan kalus dengan persentase lebih tinggi daripada aksesi Dramaga. Komposisi media yang mengandung ZPT NAA 2 sampai 6 ppm menghasilkan kalus dengan persentase 35.00 sampai 48.22 persen sedangkan komposisi media yang mengandung ZPT pikloram 2 sampai 6 ppm menghasilkan kalus dengan persentase 50.16 sampai 58.71 persen.
Persentase eksplan berkalus
Kecepatan muncul kalus eksplan petal dipengaruhi sangat nyata oleh genotipe (Tabel 13), komposisi media (Tabel 14) dan interaksi genotipe- komposisi media. Eksplan petal varietas Matahari menghasilkan kalus lebih cepat daripada varietas Simas dan varietas Simas menghasilkan kalus lebih cepat daripada aksesi Dramaga
Tabel 13 Pengaruh genotipe terhadap waktu muncul kalus dan persentase eksplan berkalus pada eksplan petal
Genotipe Waktu muncul kalus (HST) Eksplan berkalus (%) Dramaga 41.02 a 25.54 c Matahari 6.28 c 92.11 a Simas 16.44 b 76.73 b
Keterangan : Angka-angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji DMRT
(α = 0.05).
Skor ukuran kalus
Analisis dengan uji Kruskal-Wallis pengaruh komposisi media terhadap skor ukuran kalus pada eksplan petal durian menunjukkan bahwa komposisi media berpengaruh sangat nyata terhadap skor ukuran kalus pada varietas Simas, berpengaruh nyata pada varietas Matahari, tetapi tidak berpengaruh nyata pada aksesi Dramaga (Tabel 14). Pada varietas Simas terdapat kecenderungan media dasar B5 menghasilkan kalus berukuran lebih besar daripada media dasar MS. Nilai median skor 4 sampai 5 hanya didapatkan pada eksplan petal varietas Simas.
Tabel 14 Pengaruh komposisi media terhadap persentase eksplan berkalus, waktu muncul kalus, tipe kalus dan skor ukuran kalus pada eksplan petal durian
Komposisi Media
Eksplan berkalus
(%)
Waktu muncul kalus (HST) Proporsi (%) tipe kalus pada genotipe : Skor ukuran kalus
Dramaga Matahari Simas Dramaga Matahari Simas
Dramaga Matahari Simas Tipe
1 Tipe 2 Tipe 1 Tipe 2 Tipe 1 Tipe 2 Md Z Md Z Md Z B5 tanpa ZPT 22.2 e 13.9e(A) 6.4b(B) - 100 0 71.4 28.6 - - 1 0.15 1.5 0.72 - -
B5 + NAA 2 ppm 35.3 de 39.1bcd(A) 6.2b(B) 19.1a(B) 100 0 89.5 10.5 100 0 1 -0.59 1 0.04 1 -1.21
B5 + NAA 4 ppm 40.0bcde 38.9bcd(A) 6.2b(B)14.9abc(B) 100 0 94.4 5.6 86.7 13.3 1 0.83 1 -0.15 5 4.88
B5 + NAA 6 ppm 35.0 de 18.4e(A) 6.2b(B) 15.4ab(A) 90.9 9.1 88.9 11.1 100 0 1 0.05 1 -0.88 4.5 2.75
B5 + pikloram 2 ppm 58.7 a 50.5bcd(A) 6.1b(C) 21.8a(B) 100 0 52 48 65.2 34.8 1 0.49 2 0.83 5 4.99
B5 + pikloram 4 ppm 50.6 abcd 54.8b(A) 6.2b(B) 15.3ab(B) 96.3 3.7 37.9 62.1 52.6 47.4 1 0.27 2 1.23 4 1.5
B5 + pikloram 6 ppm 51.6 abcd 80.8a(A) 6.2b(C) 22.5a(B) 100 0 59.1 40.9 84.6 15.4 1 0.01 1 -1.96 2 0.15
MS tanpa ZPT 27.8 e 11.4e(A) 6.0b(B) - 100 0 93.3 6.7 - - 1 -0.59 1 -0.56 - -
MS + NAA 2 ppm 37.6 cde 13.2e(AB) 6.2b(B) 17.9a(A) 100 0 91.7 8.3 64.7 35.3 1 -0.04 1 -1.24 1 -2.87
MS + NAA 4 ppm 48.2 abcd 24.8de(A) 6.2b(B) 17.9a(A) 86.7 13.3 100 0 88.2 11.8 1 -0.16 2 1.44 1 -3.77
MS + NAA 6 ppm 37.2 cde 38.1bcd(A) 6.2b(B) 9.3bc(B) 100 0 100 0 85.7 14.3 1 -0.68 1 -0.73 1 -3
MS + pikloram 2 ppm 56.6 ab 38.8bcd(A) 6.2b(B) 7.4c(B) 100 0 82.6 17.4 90.5 9.5 1 -0.04 1 0.02 1 -3.91
MS + pikloram 4 ppm 50.2 abcd 35.4cd(A) 7.2a(B) 16.8ab(B) 100 0 96.8 3.2 64.7 35.3 1 -0.21 2 2.46 1 -0.99
MS + pikloram 6 ppm 54.7 abc 41.9bcd(A) 6.0b(C) 21.2a(B) 100 0 100 0 92.3 7.7 1 0.2 1 -1.82 2 1.26
P-value 0.01 0.00 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 0.74 0.03 0.00
Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf kecil yang sama pada kolom yang sama dan angka-angka yang diikuti huruf besar yang sama pada baris yang sama tidak
berbeda nyata pada uji DMRT (α = 0.05). Tipe 1: Kalus kompak, warna agak putih keruh sampai agak kekuningan; Tipe 2: Kalus kompak, warna putih bersih seperti kapas; -: data tidak tersedia. Skor 1: < 25%; skor 2: 25-50%; skor 3: 50-75%; skor 4: 75-100%; skor 5: > 100%. Md: nilai median skor ukuran kalus per perlakuan; Z: normal baku dari rerata ranking skor ukuran kalus pada tiap perlakuan. 27
Tipe kalus
Kalus yang tumbuh dari eksplan petal sejak awal tumbuhnya merupakan kalus tipe 1 dan kalus tipe 2. Analisis dengan Tabel Kontingensi dan Chi Kuadrat menunjukkan komposisi media berpengaruh nyata terhadap tipe kalus pada semua genotipe.
Berdasarkan keempat variabel yang diamati pada eksplan petal, komposisi media terbaik pada induksi kalus dari eksplan petal adalah media dasar B5 dengan tambahan pikloram 2 ppm. Media ini menghasilkan kalus dengan persentase tinggi, proporsi kalus tipe 1 sedang sampai tinggi, dan ukuran kalus yang besar (nilai median skor 2 dari rentang 1-2 pada varietas Matahari dan skor 5 dari rentang 1-5 pada varietas Simas) walaupun mempunyai nilai waktu muncul kalus yang cepat pada varietas Matahari, sedang pada aksesi Dramaga, dan lambat pada varietas Simas.
Dalam protokol embriogenesis somatik beberapa jenis tanaman berkayu, paling tidak ada 2 skenario untuk memperoleh kalus embriogenik. Skenario pertama adalah dari eksplan yang dikulturkan akan langsung didapatkan kalus yang sudah bersifat embriogenik. Contoh skenario ini adalah pada embriogenesis somatik nangka (Roy dan Debnath 2005). Skenario kedua melalui tahapan induksi kalus, kemudian kalus yang didapatkan (yang belum tentu embriogenik) disubkultur ke media dengan komposisi berbeda hingga didapatkan kalus yang embriogenik. Contoh skenario ini adalah pada kopi (Etienne 2005) dan kakao (Figuera dan Laurence 2005; Maximova et al. 2005). Embriogenesis somatik pada kakao melalui tahapan kultur pada media PCG, SCG, dan ED. Dua minggu setelah ditanam di media ED baru akan didapatkan 2 tipe kalus, yaitu kalus embriogenik dan non embriogenik. Induksi embrio somatik dengan skenario 2 mempunyai pola umum, yaitu pada tahap pertama eksplan dikulturkan dalam media yang mengandung auksin kuat dengan konsentrasi relatif tinggi, kemudian kalus yang diperoleh disubkultur ke media tanpa atau rendah auksin dengan atau tanpa pemberian sitokinin. Sitokinin yang paling sering dipakai adalah BA.
Kalus tipe 1 dalam penelitian ini secara morfologi lebih mirip dengan informasi tipe kalus yang berpotensi embriogenik pada kultur kakao, hanya saja strukturnya kompak dan keras, sedangkan kalus tipe 2 lebih mirip tipe kalus yang tidak pernah berasosiasi dengan embrio somatik pada kultur kakao (Maximova et al. 2005). Namun dari pengamatan histologi didapatkan kondisi sel yang menunjukkan bahwa kalus tipe 1, tipe 2, maupun tipe 3 dalam penelitian ini tidak bersifat embriogenik. Kondisi sel kalus-kalus tersebut berbeda dengan ciri sel embriogenik yaitu sel kecil bulat dengan proporsi inti sel relatif besar, dinding sel tebal dan sitoplasma pekat (Karami 2008, Gambar 5). Walaupun demikian, berdasarkan informasi tipe kalus pada kultur kakao (Maximova et al. 2005), dengan skenario 2, kalus tipe 1 masih lebih bisa diharapkan untuk berubah menjadi kalus yang embriogenik, jika didapatkan komposisi media dan protokol yang sesuai.
Gambar 5 Embriogenesis somatik dan regenerasi tanaman pada Dianthus caryophillus (Karami 2008). A: kalus tipe 1 dari eksplan petal pada MS + 2,4-D 2.0 ppm, BA 0.2 ppm dan sukrosa 9% setelah 4 MST; B: kalus tipe 2 pada media yang sama; C: irisan histologis kalus tipe 1 (non embriogenik); D: embrio somatik pada berbagai tahap perkembangan pada MS + 2,4-D 0.2 ppm dan sukrosa 3% setelah 4 MST; E: irisan histologis kalus tipe 2 (embriogenik)
Idealnya tipe kalus yang dihasilkan dipengaruhi oleh komposisi media kultur, komposisi media tertentu cenderung menghasilkan tipe kalus tertentu. Namun dalam penelitian ini pengaruh tersebut tidak terlihat jelas, bahkan sering dijumpai kedua tipe kalus dalam satu botol kultur yang ditanami dengan eksplan dari satu bunga (gambar 6). Hal ini diduga terjadi karena adanya penyebaran hormon dan fotosintat yang tidak merata pada eksplan sebelum dikulturkan atau penyerapan dan translokasi ZPT dari media yang tidak merata pada semua bagian eksplan.
