Penulis dilahirkan di Kabupaten Bone, Provinsi Sulawesi Selatan pada tanggal 4 Juni 1988 sebagai anak kedua dari lima bersaudara pasangan
Sudirman Beda dan Masniati.
Penulis diterima sebagai mahasiswa sarjana (S1) pada tahun 2007 di Institut Pertanian Bogor (Jurusan Teknologi Hasil Perairan) melalui Jalur Beasiswa Utusan Daerah (BUD) dan lulus tahun 2011. Penulis kemudian melanjutkan studi S2 (Program Magister Sains) di Institut Pertanian Bogor (Program Studi Teknologi Hasil Perairan) dan lulus tahun 2013. Penulis merupakan salah satu
penerima beasiswa dari Bakrie Center Foundation (BCF) untuk program tahun 2012.
Sebagai salah satu syarat meraih gelar Magister Sains (M.Si), penulis
melakukan penelitian tesis yang berjudul ”Isolasi Senyawa Antioksidan sebagai
Penangkal Radikal Bebas dari Buah Lindur (Bruguiera gymnorrhiza.)” dibimbing oleh Dr. Ir. Nurjanah, M.S dan Dr. Ir. Agoes Mardiono Jacoeb, Dipl.-Biol.
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat atau mencegah terjadinya oksidasi pada substrat yang mudah teroksidasi. Cadangan antioksidan dalam tubuh terbatas sehingga jika terjadi paparan radikal bebas berlebih, tubuh membutuhkan sumber antioksidan yang berasal dari luar. Antioksidan berdasarkan sumbernya dikelompokkan menjadi dua, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diperoleh secara alami dan menjadi alternatif yang potensial untuk dikembangkan sebagai pengganti antioksidan sintetik. Antioksidan alami mengandung senyawa bioaktif (Winarsi 2007).
Senyawa bioaktif dapat ditentukan melalui uji fitokimia. Senyawa tersebut berperan sebagai peningkat stamina, kekebalan tubuh, dan mencegah beberapa penyakit, yaitu kanker, penyakit pada hati, stroke, tekanan darah tinggi, katarak, osteoporosis, dan infeksi saluran pencernaan. Senyawa fitokimia yang terdapat pada tanaman, yaitu golongan alkaloid, flavonoid, kuinon, tanin, polifenol, saponin, steroid, dan triterpenoid (Juniarti et al. 2009). Penelitian Nurjanah et al.
(2013) menghasilkan adanya senyawa bioaktif golongan alkaloid, steroid, dan fenol hidrokuinon pada kangkung air (Ipomoea aquatica). Hasil penelitian
Santoso et al. (2011) juga menemukan adanya kandungan senyawa alkaloid, steroid, flavonoid, dan fenol hidrokuinon pada buah pedada (Sonneratia caseolaris). Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai sumber senyawa bioaktif adalah tanaman lindur (Bruguiera gymnorrhiza).
Tanaman lindur (B. gymnorrhiza) merupakan salah satu jenis tumbuhan yang hidup di ekosistem mangrove. Tanaman ini ditemukan di wilayah tropis Pasifik dari Asia Tenggara, Kepulauan Ryukyu, Mikronesia, dan Polinesia (Samoa) hingga wilayah subtropis Australia. Buah tanaman lindur memiliki aktivitas antivirus dan dapat melawan tumor Sarcoma I80 dan Lewis lung carcinoma serta mengandung karbohidrat tinggi sehingga memiliki potensi sebagai sumber pangan baru. Secara empiris, kulit kayunya digunakan mengobati luka bakar (Kepulauan Solomon), obat diare, dan malaria (Indonesia, Kamboja)
(Allen dan Duke 2006). Senyawa yang berperan sebagai antikanker, antidiare, dan antimalaria tersebut belum dikaji secara ilmiah. Senyawa antioksidan diduga
berperan dalam hal tersebut, sehingga kajian mengenai struktur senyawa dan aktivitas antioksidan perlu dilakukan.
Penelitian tentang antioksidan dan senyawa bioaktif tanaman air dan tanaman mangrove telah dilakukan, antara lain penelitian Xylocarpus granatum (Khrueayu dan Pilantanapak 2012), Sonneratia caseolaris (Santoso et al. 2011), Exoecaria agallocha (Sivaperumal et al. 2010, Patra et al. 2012), Avicennia marina (Zhu et al. 2009), Brugueira sexangula (Bandaranayake 2002), akan tetapi penelitian tentang tanaman lindur masih sangat sedikit. Penelitian Khrueayu dan Pilantanapak (2012) menghasilkan adanya aktivitas antijamur pada ekstrak daun B.gymnorrhiza. Penelitian Jacoeb et al. (2013) menghasilkan rendemen terbesar pada ekstrak kasar buah lindur yang diekstrak dengan metanol (7,85%). Penelitian tersebut juga menghasilkan aktivitas antioksidan tertinggi pada ekstrak
2
metanol dengan IC50 9,42 ppm, namun senyawa yang berperan sebagai antioksidan tersebut belum diketahui strukturnya.
Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan menentukan struktur senyawa antioksidan yang berfungsi sebagai penangkal radikal bebas pada ekstrak metanol buah lindur. Penelitian ini dimulai dengan pengambilan dan preparasi buah lindur, uji proksimat buah lindur, ekstraksi, pemisahan menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, dan identifikasi struktur senyawa menggunakan Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Uji aktivitas antioksidan dilakukan sebelum dan setelah pemisahan.
Perumusan Masalah
Kebutuhan manusia terhadap antioksidan meningkat seiring dengan meningkatnya polusi udara dan penyakit-penyakit degeneratif, misalnya jantung koroner. Polusi menyumbangkan radikal bebas ke udara. Radikal bebas mempunyai efek sitotoksik yang berbahaya bagi sel mamalia dan mempercepat patogenesis penyakit-penyakit kronis. Apabila tidak diinaktivasi, radikal bebas dapat merusak makromolekul termasuk low density lipoprotein (LDL) sehingga LDL menjadi termodifikasi oksidatif. Senyawa tersebut termodifikasi toksik bagi sel pembuluh darah dan menjadi awal pembentukan aterosklerosis yang pada tahap selanjutnya menyebabkan penyakit jantung coroner. Penghambatan pembentukan LDL termodifikasi dapat dilakukan oleh antioksidan.
Tanaman lindur telah banyak dimanfaatkan dan secara empiris telah digunakan untuk mengobati beberapa penyakit, misalnya malaria dan diare. Penelitian Jacoeb et al. (2013) menghasilkan buah lindur memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat (IC50 < 50 ppm) dan mengandung karbohidrat tinggi (32,91%). Informasi mengenai struktur senyawa yang berperan sebagai antioksidan belum dilakukan sehingga penelitian tentang hal tersebut perlu dilakukan.
Buah lindur mengandung karbohidrat tinggi, sehingga dapat dijadikan
sebagai sumber pangan baru. Buah ini juga berpotensi sebagai sumber antioksidan dan dimanfaatkan sebagai alternatif baru dalam bidang nutrasetika. Penelitian
mengenai struktur senyawa dan gugus antioksidan buah lindur belum dilakukan, sehingga penelitian tersebut perlu dilakukan.
Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian ini adalah mengisolasi senyawa bioaktif yang berfungsi sebagai antioksidan yang dihasilkan oleh buah lindur.
Tujuan khusus yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah: (1) Menentukan aktivitas antioksidan ekstrak kasar dan fraksi (2) Menentukan komposisi kimia dan bioaktif buah lindur tua
(3) Melakukan pemisahan senyawa bioaktif menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan memberikan informasi mengenai potensi buah lindur sebagai komoditas yang memiliki aktivitas antioksidan. Penentuan
senyawa antioksidan yang terdapat dalam buah lindur dilakukan agar senyawa tersebut dapat dimanfaatkan untuk berbagai keperluan, misalnya sebagai bahan nutrasetika, industri farmasi, dan kosmetik.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian tentang aktivitas antioksidan dan senyawa bioaktif buah lindur yang diekstrak menggunakan pelarut heksana, etil asetat, dan metanol telah dilakukan oleh Jacoeb et al. (2013). Penelitian tersebut menghasilkan metanol sebagai pelarut yang memiliki rendemen terbesar (7,85%) dan aktivitas antioksidan paling efektif (IC50 9,42 ppm). Penelitian tersebut mendasari penelitian ini sehingga metanol digunakan sebagai pelarut dalam ekstraksi tunggal buah lindur.
Penelitian ini dilaksankan meliputi tiga tahap penelitian, yaitu:
Tahap pertama: persiapan dan pengambilan contoh, ekstraksi, dan uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar.
Tahap kedua: uji proksimat, uji fitokimia, dan pemisahan senyawa ekstrak kasar buah lindur yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom serta uji aktivitas antioksidan fraksi hasil pemisahan.
Tahap ketiga: identifikasi struktur senyawa bioaktif dari fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik menggunakan Nuclear Magnetic Resonance (NMR).
2 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan bulan Oktober 2012 – Mei 2013. Buah lindur (B. gymnorrhiza) yang digunakan berasal dari Berau, Kalimantan
Timur. Proses preparasi, uji proksimat, ekstraksi, uji aktivitas antioksidan, dan uji fitokimia dilakukan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan 2, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Proses purifikasi dan identifikasi senyawa aktif antioksidan buah lindur dilakukan di Laboratorium Karakterisitik Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Laboratorium Nuclear Magnetic Resonance, Pusat Penelitian Kimia, PUSPIPTEK Serpong.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian adalah buah lindur (B. gymnorrhiza), bahan untuk ekstraksi dan pemisahan senyawa bioaktif buah
lindur, dan bahan-bahan untuk uji antioksidan (radikal bebas
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Alorich Chem
.)
, asam askorbat (HmBG Chem.) serta uji fitokimia.Alat
Alat-alat yang digunakan, yaitu orbital shaker (WiseShake), rotary evaporator (Buchi Rot. R-205), spektrofotometer UV-Vis (Hitachi U-2800), kromatografi lapis tipis (gel silica 60 F254), kromatografi kolom, Nuclear Magnetic Resonance (JEOL ECX 500 MHz), dan alat-alat gelas yang digunakan dari ekstraksi hingga pemisahan.
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap penelitian. Tahap pertama adalah pengambilan dan preparasi bahan baku, uji proksimat, ekstraksi, uji fitokimia, dan uji aktivitas ekstrak kasar buah lindur. Tahap kedua adalah
pemisahan dan uji aktivitas antioksidan fraksi hasil pemisahan. Tahap ketiga adalah identifikasi struktur senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik yang terdapat pada buah lindur.
Preprasi bahan baku
Proses preparasi meliputi pembersihan dan pengeringan buah lindur. Kulit buah lindur tidak dikupas, namun hanya dibersihkan dari kotongan yang menempel pada bagian luar. Buah lindur yang digunakan, yaitu buah lindur tua (buah hijau kecokelatan, kelopak cokelat kemerahan) dan muda (buah hijau,
kelopak hijau kecokelatan). Buah lindur yang telah bersih dikecilkan ukurannya dan dikeringkan menggunakan sinar matahari selama 3 hari. Buah lindur kering dihaluskan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk buah lindur kering dan disimpan dalam plastik pada suhu chilling untuk proses penelitian selanjutnya.
Ekstraksi senyawa bioaktif
Serbuk buah lindur kering diekstraksi menggunakan metanol dengan metode maserasi pada suhu ruang. Proses tersebut dibantu dengan goncangan menggunakan orbital shaker dengan kecepatan 150 rpm. Perbandingan sampel dan pelarut, yaitu 1:4 (b/v) (Rosyida et al. 2005). Ekstraksi dilakukan selama 48 jam kemudian dilakukan filtrasi menggunakan kertas saring Whatman 42 (Hardiningtyas 2012). Proses ekstraksi dilakukan hingga filtrat tidak berwarna (bening). Filtrat yang terkumpul kemudian dievaporasi menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 40 oC kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer sehingga diperoleh ekstrak kasar buah lindur. Diagram alir proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 1.
Hasil ekstraksi tersebut kemudian ditimbang untuk mendapatkan rendemen ekstraknya. Rendemen ekstrak kasar adalah presentase bobot ekstrak kasar yang diperoleh dalam serbuk buah lindur kering. Hasil ekstrak tersebut kemudian diuji aktivitas antioksidannya sehingga diperoleh aktivitas antioksidan terbaik yang ditandai dengan nilai IC50 yang paling rendah. Ekstrak kasar buah lindur yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik dilakukan uji fitokimia menurut metode Harborne (1987) untuk menentukan golongan senyawa bioaktif pada ekstrak tersebut.
Uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar
Aktivitas antioksidan ekstrak kasar buah lindur ditentukan menggunakan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) berdasarkan Blois (1958) dalam Hanani et al. (2005). Metode uji DPPH merupakan salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk memperkirakan efisiensi kinerja dari substansi yang
berperan sebagai antioksidan (Molyneux 2004). Metode uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan radikal bebas DPPH dipilih karena metode ini sederhana,
mudah, cepat, peka, dan hanya memerlukan sedikit sampel, tetapi jumlah pelarut pengencer yang diperlukan cukup banyak.
Metode pengujian DPPH berdasarkan pada kemampuan substansi
antioksidan tersebut dalam menetralisir radikal bebas. Radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Vattem dan Shetty 2006). Radikal bebas DPPH merupakan radikal sintetik
yang stabil pada suhu kamar dan larut dalam pelarut polar, misalnya metanol dan etanol (Molyneux 2004).
Tahap awal pengujian aktivitas antioksidan adalah mempersiapkan larutan uji. Ekstrak kasar dilarutkan dalam metanol dengan kosentrasi 10, 20, 30,
dan 40 ppm. Vitamin C (asam askorbat) digunakan sebagai kontrol positif dan pembanding dengan masing-masing kosentrasi 2, 4, 6, dan 8 ppm.
Larutan DPPH dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol dengan konsentrasi 1 mM yang dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya. Sebanyak 4,5 ml larutan uji atau larutan pembanding dimasukkan
6
dalam tabung reaksi kemudian direaksikan dengan 0,5 ml larutan DPPH. Tabung reaksi tersebut ditutup dengan alumunium foil dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm.
Gambar 1 Diagram alir proses ekstraksi.
Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya yang ditandai oleh perubahan warna ungu menjadi kuning (Molyneux 2004). Aktivitas antioksidan masing-masing sampel dinyatakan dengan presentase penghambatan radikal bebas yang dihitung dengan rumus:
Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu x
dan y. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y=b(x) + a digunakan untuk mencari nilai inhibitory concentration 50% (IC50) dengan menyatakan nilai y
sebesar 50 dan nilai x sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50%. Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas
antioksidannya semakin tinggi. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 50 ppm, kuat apabila nilai IC50 antara 50-100 ppm, sedang apabila nilai IC50 berkisar 100-150 ppm, dan lemah apabila nilai IC50 berkisar antara 150-200 ppm (Molyneux 2004).
Uji proksimat
Kandungan gizi buah lindur ditentukan menggunakan uji proksimat. Uji proksimat dilakukan berdasar pada AOAC (2005). Analisis yang dilakukan
meliputi uji kandungan air, lemak, protein, dan abu. Kadar karbohidrat diperoleh secara by difference.
Analisis kadar air
Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam.
Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan
dengan oven pada suhu 105 oC selama 5 jam atau hingga beratnya konstan. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan ditimbang kembali. Persentase kadar air (berat basah) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
A = berat sampel sebelum dikeringkan B = berat sampel setelah dikeringkan
Analisis kadar lemak
Sampel seberat 5 gram dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua
ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian sampel yang telah dibungkus dimasukkan
ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana). Kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC, setelah itu labu dimasukkan dalam desikator sampai beratnya konstan. Kadar lemak dapat dihitung berdasarkan rumus:
Keterangan:
W1 = berat sampel (g)
8
Analisis kadar abu
Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 oC, kemudian dimasukkanselama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang
hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap
lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 7 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar abu dapat dihitung dengan rumus berikut:
Analisis kadar protein
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan 0,25 gram selenium dan 3 ml H2SO4 pekat. Sampel didestruksi pada suhu 410 oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2% dan 2 tetes indikator bromchresol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% kadar protein = %N x faktor konversi Keterangan:
Faktor konversi alat = 2,51 Faktor konversi = 6,25
Kadar karbohidrat
Penentuan karbohidrat (KH) dilakukan secara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar protein dan kadar lemak, sehingga kadar karbohidrat tergantung pada faktor pengurangannya. Hal ini karena karbohidrat sangat berpengaruh terhadap zat gizi lainnya. Analisis kadar karbohidrat dapat dihitung dengan persamaan berikut:
Uji fitokimia
Pengujian fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen-komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar buah lindur terpilih. Uji fitokimia meliputi uji alkaloid, uji steroid/triterpenoid, flavonoid, dan fenol hidrokuinon. Uji tersebut dilakukan sesuai dengan metode Harborne (1987).
Alkaloid
0,05 g sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N. Pengujian menggunakan tiga pereaksi alkaloid yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Dragendorff terbentuk endapan merah hingga jingga, endapan putih kekuningan dengan pereaksi Meyer dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner.
Steroid/triterpenoid
0,05 g sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering, setelah itu ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
Flavonoid
0,05 g sampel ditambahkan 0,1 mg serbuk magnesium dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3)
0,05 g diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Adanya senyawa fenol dalam bahan ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru.
Tanin
0,05 g sampel ditambahkan FeCl3 kemudian campuran dihomogenkan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah pada campuran.
Pemisahan senyawa aktif
Pemisahan senyawa aktif ekstrak buah lindur terpilih dilakukan dalam dua tahap pemisahan. Tahap pertama adalah pemisahan dengan kromatografi lapis
tipis (KLT) menggunakan beberapa jenis pelarut yang bertujuan menentukan eluen yang sesuai untuk memisahkan senyawa aktif pada ekstrak kasar buah lindur. Tahap kedua adalah pemisahan dengan kolom kromatografi untuk memperoleh atau mengumpulkan fraksi-fraksi yang telah dipisahkan. Masing-masing fraksi tersebut kemudian diuji aktivitas antioksidannya.
Pemisahan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) (Sarker et al. 2006)
Pemisahan dengan KLT bertujuan memisahkan senyawa aktif pada ekstrak kasar dengan baik menggunakan eluen yang sesuai. Eluen ini berfungsi sebagai fase gerak pada pemisahan menggunakan kromatografi kolom. Pemisahan dengan KLT dilakukan dengan melarutkan ekstrak terpilih ke dalam pelarutnya (metanol).
10
Larutan ekstrak tersebut ditotolkan pada plat silika gel 60 F254 dengan panjang 8 cm, kemudian running pada eluen atau larutan pengembang. Pelarut yang
digunakan adalah butanol, metanol, asam asetat, dan air. Eluen dengan pemisahan terbaik kemudian dikombinasikan satu dengan yang lainnya dengan berbagai
perbandingan, dilakukan dengan mencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan bercak ekstrak terpilih pada KLT.
Pemisahan dengan kromatografi kolom (Sarker et al. 2006)
Ekstrak kasar yang akan dikolom terlebih dahulu dipreparasi menggunakan KLT. Persiapan kromatografi kolom dilakukan dengan memasang kolom pada statif secara tegak lurus. Kolom diberi glasswool pada bagian bawahnya. Sebanyak 40 g serbuk silika gel dilarutkan pada eluen terpilih sehingga diperoleh larutan silika gel. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam kolom kemudian dilanjutkan dengan penjenuhan silika gel dalam kolom. Bagian atas kolom ditutup dengan aluminium foil untuk mencegah penguapan eluen yang terdapat dalam kolom sehingga silika gel tetap dalam kondisi basah. Silika gel dijenuhkan selama 24 jam.
Ekstrak yang akan difraksinasi adalah ekstrak terpilih. Ekstrak buah lindur terpilih dilarutkan pada pelarut asal (metanol). Larutan ekstrak tersebut dimasukkan ke dalam kolom yang berisi silika gel yang telah jenuh. Ekstrak dibiarkan mengalir ke bagian penjerap kolom dan kolom terus dialiri dengan eluen (silika gel tidak boleh kering). Larutan yang keluar dari kolom ditampung pada tabung reaksi dengan masing-masing tabung reaksi berisi ±5 mL. Larutan dalam tabung reaksi kemudian dikeringkan untuk menghasilkan residu ekstrak. Fraksi hasil kromatografi kolom dilakukan pengujian KLT untuk penggabungan fraksi dengan mengacu pada kesamaan pola kromatogram. Fraksi gabungan tersebut diuji aktivitas antioksidannya.
Uji aktivitas antioksidan fraksi
Pengujian aktivitas antioksidan fraksi dilakukan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) berdasarkan Blois (1958) dalam Hanani et al. (2005). Fraksi yang diperoleh dikering-bekukan menggunakan freeze dryer sehingga diperoleh bentuk fraksi yang padat (solid). Masing-masing fraksi kemudian dibuat dalam konsentrasi 10, 20, 30, dan 40 ppm. Proses selanjutnya sama dengan pengujian pada ekstrak kasar.
Identifikasi senyawa aktif
Proses identifikasi senyawa aktif buah lindur dilakukan pada fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan terbaik (IC50 terendah). Fraksi tersebut kemudian dianalisis menggunakan alat Nuclear Magnetic Resonance (NMR) untuk menentukan struktur yang terdapat pada fraksi bioaktif yang memiliki aktivitas antioksdan terbaik.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Rendemen Ekstrak Kasar Buah Lindur
Ekstraksi dilakukan untuk memisahkan komponen-komponen senyawa aktif dari suatu bahan campuran dan dapat dilakukan menggunakan pelarut. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi dengan bantuan goncangan menggunakan
orbital shaker. Tahap awal proses ekstraksi, yaitu pengecilan ukuran dan pengeringan buar lindur. Pengecilan ukuran dan goncangan dilakukan untuk
memperbesar peluang terjadinya interaksi antara komponen aktif yang diinginkan dengan pelarut sehingga komponen tersebut larut. Pengeringan bertujuan mengurangi kadar air dalam bahan. Pengeringan yang baik ditandai dengan penurunan berat sebelum dan setelah dikeringkan. Berdasarkan BPOM (2005), nilai kadar air bahan yang baik untuk ekstraksi adalah kurang dari 10%. Kadar air rendah diduga dapat memperlancar proses ekstraksi karena komponen aktif lebih terkonsentrasi dan pelarut lebih mudah menarik senyawa aktif yang terkandung dalam suatu bahan. Hal ini juga akan mempermudah proses penguapan.
Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi adalah metanol. Pelarut metanol digunakan berdasarkan hasil penelitian Jacoeb et al. (2013) yang memiliki rendemen yang terbesar (7,85%) dibandingkan dengan heksana (0,05%), etil asetat (0,13%). Rendemen hasil ekstraksi yang diperoleh pada penelitian ini