Penulis bernama Tri Yusufi Mardiana, dilahirkan di Blitar, Jawa Timur pada tanggal 29 Maret 1975. Penulis merupakan puteri ketiga dari empat bersaudara pasangan Bapak M. Zen Haryanta dan ibu Harmini. Pendidikan Sekolah Dasar ditempuh di SD Negeri II Srengat Blitar, lulus tahun 1987. Sekolah Menengah Pertama diselesaikan pada tahun 1990 di SMP I Srengat Blitar, Sekolah Menengah Atas ditempuh di SMA I Blitar Jurusan Fisika (A1) lulus tahun 1993.
Pada tahun 1993 penulis melanjutkan di Jurusan Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Diponegoro Semarang melalui jalur PSSB (Program Seleksi Siswa Berpotensi) dan lulus Strata 1 tahun 1998. Tahun 2000 sampai sekarang, penulis bekerja sebagai staf pengajar di Fakultas Perikanan Universitas Pekalongan. Pada tahun 2003 penulis melanjutkan pendidikan Strata 2 di Institut Pertanian Bogor pada Program Studi Ilmu Perairan (AIR). Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia melalui Dana Pendidikan BPPS. Penulis telah menikah dengan Slamet Suharto, SPi dan telah dikaruniai dua anak, Hakimah Nur Yusla dan Mohammad Ghatfan Atiwiar.
DAFTAR TABEL ……… xi
DAFTAR GAMBAR ………... xii
DAFTAR LAMPIRAN ……… xiii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ………... 1
Perumusan dan Pendekatan Masalah ……… 2
Tujuan dan Manfaat ………... 3
TINJAUAN PUSTAKA
Ikan Sumatra ………. 4
Penggunaan Sperma dari Spesies yang Berbeda .……… 4
Ginogenesis ……… 5
Verifikasi Genetik Ikan Klon ………. 9
RAPD …… ……….. 9
Determinasi Kelamin ………... 11 Karakter Meristik ………... 11 METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian ……… 13
Metode Penelitian ……….. 13
Ginogenesis ……….. 13
Pemeliharaan Induk Ikan Sumatra dan Ikan Tawes …… 13
Pemijahan Ikan Sumatra ………. 13
Produksi Klon dengan Metode Ginogenesis …………... 14 Verifikasi Genetik Ikan Klon ………... 16
RAPD……. ………. 16
Isolasi DNA Genom Ikan ……….. 16
Analisis RAPD ………... 17
Identifikasi Jenis Kelamin………... 20
Karakterisasi Meristik ………. 20
Analisis Data ……… 20
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keberhasilan Klon Melalui Ginogenesis ………. 22 Karakteristik Genetik Ikan Klon ……….. 24
RAPD …… ………. 24
Determinasi Kelamin………... 27
Karakter Meristik ……… 27
DAFTAR PUSTAKA ……….. 31
Halaman
1 Spesies donor sperma pada ginogenesis dari beberapa spesies berbeda ………...
5
2 Primer-primer yang digunakan dalam RAPD-PCR………. 18
3 Campuran komponen PCR ……….. 19
4 Siklus, proses, suhu dan waktu dalam amplifikasi genom ikan sumatra………
19
5 Rerata keberhasilan ginogenesis menggunakan sperma ikan tawes yang diradiasi dan suhu kejutan 40 oC selama 1.5 menit ………….
23
6 Jumlah pita DNA dan jumlah pita polimorfik hasil amplifikasi DNA ikan sumatra dengan primer OPA2 dan OPA4………...
25
7 Kisaran dan keragaman ciri meristik pada ikan sumatra K2N, mitogen dan klon ……….
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Penampilan morfologis ikan sumatra (Puntius tetrazona) betina dan jantan …………...
4
2 Penampilan morfologis ikan tawes jantan (Puntius gonionotus) …. 5
3 Diagram ginogenesis pada ikan ……… 8
4 Diagram skematik produksi klon ………. 15
5 Pola-pola pita 13 sampel ikan sumatra hasil RAPD mengunakan primer OPA 4 ………...
25
6 Dendrogram kesamaan genetik ikan sumatra normal, mitogen dan klon ………...
1 Komposisi Cell lysis Solution 38
2 Komposisi TE 1x……….. 38
3 Komposisi TAE 50x ………... 38
4 Komposisi TBE 10x ……… 38
5 Komposisi Loading dye 6x……….. 38
6 Keberhasilan mitogen dengan menggunakan metode ginogenesis tahap I ………..
39
7 Keberhasilan produksi klon dengan metode ginogenesis tahap II menggunakan induk mitogen pada percobaan 1 ………..
40
8 Keberhasilan produksi klon dengan metode ginogenesis tahap II pada percobaan 2 ………
40
9 Keberhasilan produksi klon dengan metode ginogenesis tahap II pada percobaan 3 ……….
40
10 Keberhasilan produksi klon dengan metode ginogenesis tahap II menggunakan induk mitogen ………..
41
11 Hasil spektofotometer DNA genom ikan sumatra normal ……….. 42
12 Hasil spektrofotometer DNA genom ikan sumatra mitogen ……... 42
13 Hasil spektrofotometerv DNA genom ikan sumatra klon ………... 42
14 Hasil ekstraksi DNA ikan sumatra normal, mitogen, klon ……….. 43
15 Pola-pola pita 12 sampel ikan sumatra normal, mitogen dan klon hasil RAPD mengunakan primer OPA 2 ………
43
16 Pola-pola pita 12 sampel ikan sumatra normal, mitogen dan klon hasil RAPD mengunakan primer OPA 2 ……….
44
hasil RAPD mengunakan primer OPA 4 ……….
18 Hasil pengukuran meristik ikan sumatra normal ………. 45
19 Hasil pengukuran meristik ikan sumatra mitogen ………... 46
20 Hasil pengukuran meristik ikan sumatra klon ………. 47
PENDAHULUAN Latar Belakang
Kegiatan penelitian terhadap berbagai aspek akuakultur memerlukan ikan percobaan yang homogen sehingga pengaruh perlakuan tidak bias dengan ragam yang tinggi antar individu ikan percobaan. Ikan uji yang homogen semakin diperlukan untuk kajian respon penyakit ikan, evaluasi pakan, pengujian obat, evaluasi strain dan sebagainya (Sumantadinata 1997).
Ikan sumatra (Puntius tetrazona Bleeker) atau yang dikenal dengan nama tiger barb memiliki warna dasar kuning dengan belang hitam. Ikan ini dipertimbangkan sebagai ikan percobaan karena dapat memenuhi persyaratan seperti siklus hidupnya yang pendek (5-6 bulan), proses budidayanya mudah, selain itu juga memiliki ornamen warna yang menarik dan berukuran relatif kecil (3-6 cm).
Pembuatan individu yang homozigot dengan cara seleksi konvensional membutuhkan waktu yang lama. Thomson (1983) menyatakan bahwa satu generasi ginogenesis menghasilkan tingkat homozigositas yang sama dengan tujuh sampai delapan generasi perkawinan sekerabat (sib mating). Menurut Allendorf dan Leary (1984) galur murni dapat dihasilkan dengan 2 generasi ginogenetik, sedangkan dengan perkawinan sekerabat membutuhkan 20 generasi.
Pembentukan klon ikan dengan teknologi ginogenesis telah berhasil dilakukan antara lain pada zebra fish (Danio rerio) (Streisinger et al. 1981),
medaka/japanese fish Oryzias latipes (Naruse et al. 1985), common carp
Cyprinus carpio (Komen et al. 1991), ayufishPlecoglossus altivelis (Han et
al. 1991), amago salmon Oncorhynchus rhodurus (Kobayashi et al. 1994)
dan tilapia Oreochromis niloticus (Muller-Belecke and Horstgen-Schwark
2000).
Teknologi ginogenesis pada ikan sumatra telah dilakukan oleh Soelistyowati et al. (2004) dimana lama waktu kejutan panas yang optimal
2 untuk menghasilkan persentase kelangsungan hidup larva tertinggi adalah 90 detik yaitu sebesar 15%, dengan kelangsungan hidup miogen lebih tinggi daripada mitogen. Kelangsungan hidup tertinggi dicapai saat kejutan panas diberikan pada menit ke-1 setelah pembuahan untuk miogen (9.19%) dan pada menit ke-18 setelah pembuahan untuk mitogen (7.7%).
Verifikasi status genetik ikan klon dapat dilakukan dengan tissue
grafting, DNA fingerprint SSRa-PCR dan RAPD. Verifikasi status klon
dengan metode RAPD dipakai pada tilapia (Jenneckens et al. 1999). Metode tissue grafting telah diteliti pada ayu fish (Han et al. 1991),
Cyprinus carpio (Komen et al. 1991), salmon (Kobayashi et al. 1994).
Metode DNA fingerprint telah dilakukan pada ayu (Han et al. 1991),
japanese flounder (Hara et al. 1993), rainbow trout (Young et al. 1995), red
sea bream (Kato et al. 2001).
Secara umum teknik RAPD cukup sederhana, murah dan dapat dikerjakan dalam waktu relatif singkat dibandingkan dengan teknik molekular lain (Darmono 1996; Prana dan Hartati 2003). Kuantitas DNA yang dibutuhkan hanya sedikit (dibutuhkan 5-25 ng DNA dalam setiap reaksi PCR) bahkan hingga 1.5 ng DNA (Pandey et al. 1996).
Perumusan dan Pendekatan Masalah
Kegiatan akuakultur tentang kajian respon penyakit ikan, evaluasi pakan, pengujian obat dan sebagainya, memerlukan ikan uji atau ikan percobaan yang relatif homogen secara genetis untuk menghindari bias yang ditimbulkan oleh faktor keragaman individu sehingga akurasinya bisa dipertanggungjawabkan. Homogen secara genetis yaitu memiliki homozigositas genotipik, diutamakan untuk menciptakan populasi/strain hewan percobaan. Pembuatan individu yang homozigot dengan cara seleksi konvensional membutuhkan waktu yang lama. Teknologi ginogenesis dalam dua generasi merupakan alternatif untuk menghasilkan klon. Klon hasil ginogenesis diharapkan bergenotip homozigot pada hampir seluruh gen, karena merupakan copy genom dari induk yang bergenotip homozigot. Produksi klon ikan dengan metode ginogenesis adalah produksi embrio
3
3 tanpa materi genetis jantan, dimana pada tahap I (F1) menghalangi pembelahan mitosis I sehingga dihasilkan diploid ginogenetik homozigot dan pada tahap II (F2) menghalangi keluarnya badan polar II pada meiosis II yang menghasilkan copy genom yang disebut klon. Verifikasi genetik homozigositas klon ikan sumatra akan dianalisis dengan RAPD.
Tujuan dan Manfaat
Tujuan penelitian ini adalah untuk menerapkan teknologi ginogenesis dalam memproduksi klon ikan sebagai hewan percobaan serta melakukan verifikasi genotipik berdasarkan analisis RAPD, determinasi kelamin dan karakterisasi meristik pada ikan sumatra. Hasil penelitian ini diharapkan bermanfaat untuk mengembangkan metode pemurnian genotip homozigot dalam produksi massal strain klon untuk hewan percobaan.
Ikan Sumatra
Berdasarkan klasifikasinya ikan sumatra (Puntius tetrazona Bleeker) termasuk dalam famili Cyprinidae, sub famili Cyprininae, pada genus Puntius dengan nama spesies Puntius tetrazona Bleeker (Saanin 1984). Ikan sumatra dikenal dengan nama sumatra barb atau tiger barb. Bentuk tubuhnya memanjang dan pipih ke samping, ukuran tubuh maksimal 8 cm, warna dasar tubuhnya putih keperakan, bagian atas tubuhnya berwarna agak sawo matang dengan corak hijau, sedangkan sisi tubuhnya berwarna kemerah-merahan, terdapat empat buah garis berwarna hitam kebiruan yang memotong tubuh ikan yaitu pada bagian kepala, tubuh bagian depan sirip punggung, samping sirip punggung hingga jari-jari sirip anal yang pertama, bagian batang ekor (Gambar 1). Bagian sirip punggung ada yang berwarna hitam sedang beberapa lain berwarna kemerahan dan transparan (Sumpeno et al. 2004). Berdasarkan pemijahannya ikan sumatra termasuk ikan yang menghamburkan telurnya, telur akan disebarkan diantara tanaman air dan menetas 24 jam kemudian. Jumlah telur antara 150-200 butir/ekor (Sastrapraja et al. 1981).
Gambar 1 Penampilan morfologis ikan sumatra (Puntius tetrazona) betina (kiri) dan jantan (kanan).
Penggunaan Sperma dari Spesies yang Berbeda
Penggunaan sperma ikan dari spesies yang berbeda pada percobaan ginogenesis untuk memudahkan dalam verifikasi (konfirmasi) keturunan yang dihasilkan, yaitu terdapat perbedaan karakteristik yang jelas pada keturunan ginogen dan hibrid, atau sebagai penanda genetik (Disney et al. 1987). Beberapa contoh
5
ginogenesis menggunakan donor sperma yang berasal dari spesies berbeda disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Spesies donor sperma pada ginogenesis dari beberapa spesies yang berbeda
Spesies Spesies donor sperma Sumber
Plecoglossus altivelis Spirinchus lanceolata Taniguchi et al. (1990) Common carp Osteochilus hasselti
Puntius gonionotus
Hypopthalmichthys molitrix Ctenopharyngodon idella
Sumantadinata et al. (1990)
Puntius gonionotus Puntius schwanenfeldii Siraj et al. (1993) Clarias sp. Puntius gonionotus Yulintine (1995) Tinca tinca Common carp Linhart et al. (1995)
Klasifikasi ikan tawes termasuk dalam famili Cyprinidae, sub famili Cyprininae, genus Puntius dengan spesies Puntius gonionotus (Saanin 1984) (Gambar 2). Menurut Risnawati (1995), sperma ikan tawes dapat digunakan untuk ginogenesis pada ikan sumatra karena memiliki ukuran diameter kepala spermatozoa yang lebih kecil daripada ikan sumatra yaitu 1.496 versus 1.907 µm dan panjang ekor sperma 31.147 versus 30.187 µm sehingga sperma ikan tawes dapat masuk ke dalam lubang mikrofil dan menginseminasi telur ikan sumatra.
Gambar 2 Penampilan morfologis ikan tawes (Puntius gonionotus) jantan.
Ginogenesis
Ginogenesis adalah proses produksi embrio dari telur-telur yang dibuahi oleh sperma tanpa sumbangan bahan genetik jantan (Nagy et al. 1978; John et al. 1984).
Menurut Sumantadinata (1997), teknologi ginogenesis memberikan banyak manfaat diantaranya (1) mempercepat proses pemurnian (homozigositas), (2) membuat populasi klon hanya dalam dua generasi, (3) membuat populasi tunggal kelamin betina, misalnya pada ikan mas, (4) mempercepat proses seleksi dan (5) mendeterminasi genotip jenis kelamin betina. Ginogenesis dapat terjadi secara alami dan buatan. Ginogenesis secara alami jarang terjadi karena pada umumnya spermatozoa yang membuahi sel telur dalam keadaan aktif (Golovinskaya 1972). Namun, ginogenesis dapat berlangsung secara spontan seperti Pb II yang akan keluar bertabrakan dengan spermatozoa yang akan masuk sehingga gamet jantan tidak jadi masuk dan Pb II tetap berada pada posisinya (double haploid). Menurut Cherfas (1981), ginogenesis alami dapat terjadi pada ikan crusian carp (Carrasius auratus gibelio) dan vivipar kecil dari famili Poeciliidae (Poecilia dan Poeciliopsis).
Menurut Nagy et al. (1978) dan Sumantadinata (1997), ada dua tahap penting dalam ginogenesis buatan. Pertama menonaktifkan bahan genetik dari gamet jantan, antara lain dapat dilakukan dengan cara radiasi. Kedua meningkatkan jumlah zigot diploid dengan cara pemberian kejutan panas pada fase meiosis II atau mitosis I. Penggunaan sinar UV untuk inaktifasi materi genetik lebih banyak digunakan karena selain murah, lebih mudah dan aman digunakan dibandingkan dengan sinar gamma, sinar X dan betta (Lou dan Purdom 1984; Horvath dan Orban 1995). Perlakuan meradiasi sperma tidak menyebabkan berkurangnya kemampuan sperma sebagai fungsi membuahi telur dan sebagai trigger perkembangan embrio (Streisinger et al. 1981; Arai 2001). Menurut Chourrout (1984), keberhasilan inaktifasi materi genetik jantan dengan cara radiasi sperma, bila membuahi betina akan menghasilkan embrio haploid yang tidak bertahan hidup. Menurut Sumantadinata et al. (1990), pada ginogenesis ikan mas, proses radiasi sperma dapat dilakukan dengan menggunakan dua lampu UV yang masing-masing berkekuatan 15 watt untuk meradiasi sperma dengan jarak penyinaran 15 cm.
Perlakuan kejutan dapat berupa kejutan dingin (Purdom 1969; Cherfas et al. 1994), kejutan panas (Hollebecq et al. 1986; Komen et al. 1991; Cherfas et al. 1994; Galbusera et al. 2000) dan kejutan tekanan (Onozato 1984; Perruzi dan Chatain
7
2000). Berbagai macam kejutan tersebut mempunyai efektifitas yang berbeda untuk beberapa spesies ikan. Kejutan panas dan dingin sering dilakukan dalam ginogenesis ikan karena tidak memerlukan peralatan khusus. Sedangkan kejutan tekanan banyak digunakan pada hewan amfibi. Walaupun metode kejutan tekanan hidrostatik membutuhkan peralatan yang khusus dan lebih mahal, namun metode ini masih terus dikembangkan karena resiko kerusakan embrio lebih sedikit. Penggunaan bahan kimia juga digunakan untuk menahan proses pembentukan badan polar II pada telur ikan yang baru dibuahi, antara lain dengan colchisine pada poliploid ikan brook trout (Smith dan Lemoine 1979), nitrous oxide (Shelton et al. 1986) pada triploid ikan rainbow trout.
Kejutan diberikan pada saat yang tepat setelah pembuahan (Hollebecq et al. 1986), pada saat meiosis kedua atau mitosis pertama (Lou dan Purdom 1984; Taniguchi et al. 1988; Komen et al. 1988). Pemberian kejutan panas pada saat meiosis kedua dimaksudkan untuk menahan keluarnya badan polar kedua sehingga menghasilkan diploid ginogenetik. Sedangkan pada mitosis pertama, kejutan panas akan menghalangi pemisahan genom haploid maternal yang telah mengalami segregasi total sehingga menghasilkan zigot diploid (double haploid) (Chourrout 1984).
Menurut Taniguchi et al. (1988), diploid ginogenetik yang dihasilkan dari perlakuan diploidisasi pada saat meiosis kedua dinamakan diploid ginogenetik meiotik (G2N-meiotik/meiogen), sedangkan diploid ginogenetik yang dihasilkan pada perlakuan diplodisasi saat mitosis pertama dinamakan diploid ginogenetik mitotik (G2N-mitotik/mitogen). Menurut Tave (1986) dan Purdom (1993), individu ginogen dimungkinkan mengalami penyimpangan biologis maupun fisiologis yang diduga terkait dengan proses ginogenesis maupun munculnya gen-gen resesif yang tidak menguntungkan.
Pada G2N-meiotik genotip diploid berasal dari 1N kromosom pronukleus betina dan 1 N badan polar II. Dengan demikian genotip meiogen dipengaruhi oleh pindah silang antar gen pada lokus yang sama. Sedangkan pada G2N-homozigot/ mitogen merupakan double haploid kromosom pronukleus betina (1 sel telur).
Pb 1 Duplikasi genom Oocyte Menghalangi pembelahan Menahan Pb II
Gino 1n Gino 2n Gino 2n
Inviable homozigot heterozigot Ovulasi
Synapsis, Crossing over
Inseminasi dengan sperma yang
diin-aktivasi UV
Pb 2 Pb 2
Gambar 3 Diagram ginogenesis yang menghasilkan tipe ginogen homozigot atau heterozigot (Aray, 2001)
9
Ikan klon adalah individu homozigot identik dengan induknya, yaitu dihasilkan melalui proses ginogenesis dua tahap (Sumantadinata 1997; Arai 2001). Ginogenesis tahap pertama (generasi I) menghasilkan G2N-mitotik yaitu individu homozigot identik (double haploid) dengan cara menghambat pembelahan pada fase mitosis I. Ginogenesis tahap II (generasi II) adalah perbanyakan individu yang identik dengan G2N-mitotik (generasi I) dengan melakukan ginogenesis fase meiosis yaitu mencegah keluarnya badan kutub II. Klon hasil ginogenesis pada tahap II diharapkan bergenotip homozigot pada hampir seluruh gen, karena merupakan kopi genom dari genotip homozigot (G2N-mitotik).
Verifikasi Genetik Ikan Klon RAPD
Verifikasi genetis ikan klon dapat dilakukan dengan berbagai metode antara lain dengan tissue grafting, DNA fingerprint SSRa-PCR dan RAPD. Tissue grafting pernah dilakukan pada ayu fish (Han et al. 1991), Cyprinus carpio (Komen et al. 1991), salmon (Kobayashi et al. 1994). Metode DNA fingerprint telah dilakukan pada ayu fish (Han et al. 1991), japanese flounder (Hara et al. 1993), rainbow trout (Young et al. 1995), red sea bream (Kato et al. 2001). Sedangkan metode SSRa-PCR dan RAPD digunakan pada tilapia (Jenneckens et al. 1991).
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) adalah salah satu metode yang digunakan untuk analisis profil DNA genom. Teknik RAPD ini merupakan suatu metode analisis DNA genom dengan cara melihat pola pita DNA yang dihasilkan setelah DNA genom diamplifikasi menggunakan primer acak. Prinsip dasar RAPD adalah komplementasi urutanbasa primer dengan urutan basa DNA cetakan. Apabila terdapat komplementasi urutan basa antara primer dan DNA cetakan, maka primer akan menempel pada kedua ujung 3’OH utas DNA cetakan. Jika kedua situs penempelan primer berada dalam jarak yang dapat diamplifikasi, maka produk PCR akan diperoleh berupa fragmen atau pita DNA (Tingey et al. 1992).
Metode RAPD mendeteksi polimorfisme urutan nukleotida pita DNA hasil amplifikasi PCR dengan hanya menggunakan satu primer tunggal. Primer tersebut
akan berpasangan dengan utas tunggal DNA genom yang satu dan pada utas DNA pasangannya dengan orientasi yang berlawanan. Selama situs penempelan primer masih berada dalam jarak yang masih dapat diamplifikasi, maka akan diperoleh produk DNA amplifikasi. Jarak tersebut umumnya tidak lebih dari 5000 bp. Semakin pendek fragmen yang akan diamplifikasi semakin efisien amplifikasinya (Tingey et al. 1992; Weising et al. 1995).
Rata-rata jumlah fragmen DNA yang dihasilkan sebuah primer tunggal tergantung pada kekompleksan genom. Makin kompleks suatu genom akan makin kompleks pola fragmen RAPD yang dihasilkan (Grattapaglia et al. 1992). Disamping itu jumlah dan kualitas fragmen RAPD yang dihasilkan bergantung pada panjang dan komposisi nukleotida penyusun primer, konsentrasi dan kemurnian DNA cetakan, konsentrasi ion magnesium, aktivitas dan jumlah DNA polimerase dan temperatur penempelan (Matondang et al. 2001; Promega 2001).
Secara umum RAPD lebih mudah, lebih murah, dan tekniknya lebih cepat dibandingkan dengan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats) dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Darmono 1996). Hal ini didasarkan pada : (1) tidak memerlukan pengetahuan latar belakang genom yang akan diteliti, (2) primer secara universal dapat digunakan untuk organisme prokariot maupun eukariot, (3) mampu menghasilkan karakter yang relatif tidak terbatas jumlahnya, (4) bahan-bahan yang digunakan relatif murah, (5) mudah dalam hal preparasi dan (6) memberikan hasil lebih cepat dibandingkan dengan analisis keragaman molekuler lainnya. Selain itu ada beberapa kelemahan RAPD. Darmono (1996) merangkum kelemahan dari RAPD dari beberapa publikasi : (1) pemunculan pita DNA kadang-kadang tidak konsisten. Hal ini lebih sering terjadi jika suhu penempelan yang digunakan terlalu tinggi, (2) ruas DNA berulang sering berlipat ganda, (3) homologi urutan nukleotida pada pita-pita DNA dengan mobilitas yang pada gel tidak diketahui, (4) penanda RAPD bersifat dominan. Jumlah primer yang digunakan dalam analisis sangat bergantung pada tujuan atau jenis informasi yang diinginkan.
11
Determinasi Kelamin
Jenis kelamin suatu individu ditentukan bersama oleh faktor genetis dan lingkungan. Faktor genetik yang menentukan jenis kelamin adalah kromosom, sedangkan kromosom yang memegang peranan utama dalam menentukan jenis kelamin adalah kromosom kelamin atau gonosom. Faktor lingkungan seringkali berpengaruh terhadap perubahan jenis kelamin. Perubahan ini menyebabkan karakter kelaminnya berubah, namun susunan genetisnya tidak berubah. Jenis kelamin zigot merupakan hasil keseimbangan antara jumlah gen penentu jantan dan betina, sedangkan diferensiasi kelamin secara fungsional diatur oleh mekanisme genetik melalui sistem endokrin embrio dimana prosesnya dipengaruhi oleh faktor lingkungan.
Pengamatan jenis kelamin ikan dapat dilakukan secara visual dengan mengamati ciri kelamin sekunder. Ikan sumatra betina dapat dibedakan dengan bentuk tubuh yang lebih penuh dan warna merah yang lebih sedikit pada sirip ventral, juga di bagian hidung (Innes 1994). Pada ikan sumatra jantan, sirip dan hidung berwarna lebih merah dibandingkan ikan betina. Keaadan ini akan terlihat jelas pada saat ikan sumatra akan memijah (Mc Inerny dan Gerard 1966).
Karakter Meristik
Pola pewarisan ciri meristik dapat digunakan untuk menelusuri hubungan kekerabatan yang lebih spesifik dalam penelitian ginogenesis, dalam hal ini untuk mengetahui keberhasilan segregasi dan rekonstruksi genom pada produksi G2N-mitotik maupun klon. Pengukuran karakter meristik pada ikan diploid ginogen (G2N) telah dilakukan oleh beberapa peneliti. Pada ikan mas, ukuran tubuh (panjang standar) pada miogen dan G2N-mitotik tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kontrol normal pada umur yang sama (3 bulan), demikian pula dengan variasi karakter meristik (jumlah vertebrate, jumlah tulang lunak sirip dan jumlah lembar insang). Nilai variasi fenotif (Vp) pada G2N-mitotik kurang dari dua kali individu normal pada kebanyakan sifat morfometrik dan nilai Vp tersebut lebih dari dua kali individu normal untuk kebanyakan sifat meristik. Fenomena tersebut dapat
diterangkan melalui rumus tentang Vp = Vg(1+F) + Ve untuk meiogen dan Vp = 2Vg+Ve untuk mitogen (Sumantadinata et al. 1990).
METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Nopember 2004 sampai April 2006, di Kolam Babakan Sawah Baru, Laboratorium Pengembangbiakan dan Genetika Ikan FPIK IPB dan Pusat Studi Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PSSHB) IPB Bogor.
Metode Penelitian Ginogenesis
Pemeliharaan Induk Ikan Sumatra dan Ikan Tawes
Induk ikan sumatra jantan dan betina dipelihara secara terpisah dalam akuarium berukuran 100x50x50 cm dengan menggunakan sistem double bottom menggunakan batuan zeolit dan diberi aerasi, pakan yang diberikan berupa Chironomus sp. dan pakan buatan berupa pelet. Ikan tawes (Puntius gonionotus Blekeer) jantan sebagai pendonor sperma dipelihara terpisah dalam kolam dan diberi pakan pelet.
Pemijahan Ikan Sumatra
Induk ikan sumatra yang akan dipijahkan terlebih dahulu dipuasakan selama satu hari untuk mencegah terjadinya penyumbatan lemak pada saluran telur atau sperma dan untuk mempermudah dalam memilih induk betina yang siap memijah. Pemijahan dilakukan pada akuarium berukuran 20x20x20 cm yang telah diisi air dengan ketinggian 10 cm dan sekelilingnya ditutup dengan plastik berwarna hitam diberi aerasi kecil dan enceng gondok. Ikan sumatra jantan dan betina disatukan pada pukul 21.00 WIB dengan perbandingan 1 : 1. Pengamatan induk betina yang memijah dilakukan keesokan harinya.
Produksi Klon dengan Metode Ginogenesis
Ginogenesis Tahap I (Mitogen) dan Ginogenesis Tahap II (Klon)
Pemijahan akan ditandai dengan pengeluaran telur (biasanya menempel pada akar enceng gondok atau tersebar pada dasar akuarium). Ikan sumatra yang memijah diambil lalu distripping (diurut bagian perutnya secara perlahan-lahan menuju anus), kemudian telur ditampung dan didistribusikan dalam 6 cawan : 3 cawan masing-masing untuk kontrol normal (K2N), kontrol hibrid (K2H), kontrol UV (KUV) dan 3 cawan lainnya untuk perlakuan ginogenesis dengan waktu inisiasi kejutan panas yang berbeda-beda sesuai dengan tahapannya (mitoginogenesis pada tahap I atau meioginogenesis pada tahap II).
Sperma ikan tawes (donor) dan ikan sumatra diambil secara terpisah menggunakan syringe tanpa jarum dengan cara mengurut pada bagian perutnya menuju anus, kemudian sperma ikan tawes diencerkan 100 kali dalam labu erlenmeyer menggunakan larutan fisiologis merk dagang Otsu-Ns (Normal saline) dengan komposisi Osmolarity 306 Osm/l dan 0.9% b/v sodium chloride. Sebagian sperma ikan tawes digunakan untuk pembuahan pada K2H dan sebagian lainnya