DAFTAR LAMPIRAN
C. Saccharomyces cerevisiae var ellipsoideus
Saccharomyces cerevisiae merupakan salah satu spesies khamir yang memiliki daya konversi gula menjadi etanol sangat tinggi. Mikroba ini biasanya dikenal dengan baker’s yeast dan metabolismenya telah dipelajari dengan baik. Produk metabolik utama adalah etanol, CO2 dan air sedangkan beberapa produk
lain dihasilkan dalam jumlah sangat sedikit. Khamir ini bersifat fakultatif anaerobik. Saccharomyces cerevisiae memerlukan suhu 30oC dan pH 4,0-4,6 agar dapat tumbuh dengan baik. Selama proses fermentasi akan timbul panas, apabila tidak dilakukan pendinginan, suhu akan makin meningkat sehingga proses fermentasi terhambat (Oura di dalam Delwegg, 1983).
Saccharomyces cerevisiae tumbuh optimum pada suhu 25-30oC dan maksimum pada 35-47oC (Frazier dan Westhoff, 1978). pH pertumbuhan khamir yang baik antara 3-6. Perubahan pH dapat mempengaruhi pembentukan hasil samping fermentasi. Pada pH tinggi maka lag phase akan berkurang dan aktivitas fermentasi akan naik (Prescott dan Dunn, 1959). Pertumbuhan mikroba di dalam suatu kultur mempunyai kurva seperti terlihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Mikroba (Stanburry dan Whitaker, 1984).
Dalam industri fermentasi diperlukan substrat yang murah, mudah tersedia dan efisien penggunaannya. Substrat yang digunakan harus dapat difermentasi.
7 Pemilihan substrat harus memperhitungkan jumlah karbon yang tersedia di dalamnya. Karbohidrat merupakan sumber energi tradisional dalam industri fermentasi. Glukosa dan sukrosa jarang digunakan sebagai satu-satunya sumber karbon karena mahal harganya. Beberapa proses fermentasi dalam skala besar menggunakan garam amonium, urea, atau gas amonia sebagai sumber nitrogen (Fardiaz, 1988).
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus merupakan galur khamir yang biasa digunakan untuk pembuatan minuman keras (wine) dan mampu menghasilkan rendemen alkohol tinggi (Frazier dan Westhoff, 1978). Pada awal klasifikasi, khamir diklasifikasikan berdasarkan kemampuan fermentasi dan morfologi selnya. Nama Saccharomyces cerevisiae digunakan untuk khamir dari industri bir di Jerman dan Inggris, sedangkan nama Saccharomyces ellipsoideus
merupakan jenis khamir anggur yang mempunyai bentuk ellipsoidal. Pada klasifikasi ulang ditemukan bahwa perbedaan morfologi saja, tidak cukup untuk membedakan dua spesies khamir, sehingga nama khamir anggur menjadi
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus (Campbell di dalam Priest dan Campbell, 1999). Perbedaan morfologi Saccharomyces cerevisiae dan
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Morfologi Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus (A) dan
Saccharomyces cerevisiae (B) (Pelczar dan Chan, 1986)
D. FERMENTASI
Menurut Prescot dan Dunn (1981), etanol dapat diproduksi dari gula melalui fermentasi pada kondisi tertentu. Sedangkan pati dan karbohidrat lainnya dapat dihidrolisa menjadi gula kemudian difermentasi untuk membentuk etanol yang merupakan nama kimia untuk alkohol dengan rumus kimia C2H5OH.
8 Bioetanol adalah cairan biokimia dari proses fermentasi gula dari sumber karbohidrat menggunakan bantuan mikroorganisme.
Khamir memerlukan medium dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan dan perkembang-biakannya. Unsur-unsur dasar yang dibutuhkan adalah karbon, hidrogen, oksigen, fosfor, zat besi dan magnesium. Unsur karbon banyak diperoleh dari gula, sumber nitrogen didapatkan dari amonia, asam amino, peptida, pepton nitrat, atau urea tergantung pada jenis khamir. Fosfor merupakan unsur penting dalam kehidupan khamir terutama untuk pembentukan alkohol dari gula.
Pada permulaan proses fermentasi, khamir memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya sehingga fermentasi berlangsung secara aerob. Setelah terbentuk CO2, reaksi akan berubah menjadi anaerob. Alkohol yang terbentuk akan menekan
fermentasi lebih lanjut setelah tercapai konsentrasi antara 13-15% volume. Terhalangnya proses fermentasi, juga dipengaruhi suhu proses dan jenis khamir yang digunakan (Prescot dan Dunn, 1981).
Khamir tumbuh baik pada kondisi aerobik, walaupun demikian beberapa khamir dapat tumbuh pada kondisi anaerobik. Proses respirasi pada kondisi aerobik selanjutnya digantikan proses fermentasi pada kondisi anaerobik karena tidak tersedia lagi oksigen. Khamir akan selalu berespirasi pada setiap keadaan yang memungkinkan karena energi yang dihasilkan pada resprasi jauh lebih besar dibandingkan pada proses fermentasi. (Barnett et al., 2000). Bila terdapat udara pada proses fermentasi maka etanol yang dihasilkan lebih sedikit karena terjadi respirasi yang mengakibatkan terjadinya konversi gula menjadi sel, karbondioksida, dan air.
Suhu optimum pertumbuhan khamir adalah pada suhu 25-30oC dan maksimum pada 35-47oC. Sedangkan pH optimum 4-5. Batas minimal aw untuk
khamir biasa adalah 1.88-1.92. Menurut Casida (1968) pH pertumbuhan khamir yang baik adalah pada rentang 3-6. Perubahan pH dapat mempengaruhi pembentukan hasil samping fermentasi. Nilai pH pertumbuhan behubungan positif dengan pembentukan asam piruvat. Pada pH tinggi maka fase lag akan lebih singkat dan aktivitas fermentasi akan meningkat. Pengaruh pH pada pertumbuhan khamir juga tergantung pada konsentrasi gula dan etanol. Nilai pH dapat
9 diturunkan menggunakan asam sitrat, sedangkan untuk menaikkan pH dapat digunakan natrium benzoat.
Paturau (1991) menyatakan bahwa fermentasi etanol memakan waktu 30- 72 jam. Prescot dan Dunn (1981) menyatakan bahwa waktu fermentasi etanol adalah 3-7 hari. Amerine dan Cruess (1960) menyatakan bahwa proses pemecahan gula menjadi etanol dan CO2 dilakukan oleh sel khamir. Secara teoritis konversi
molekul gula menjadi 2 molekul etanol dan 2 molekul CO2 menurut persamaan Gay Lussac sebagai berikut
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2
(gula) (etanol) (karbondioksida)
Berdasarkan persamaan Gay Lussac dapat dijelaskan bahwa 51.1% gula diubah menjadi etanol dan 49.9% diubah menjadi karbondioksida. Akan tetapi hasil ini kebanyakan tidak dapat dicapai karena adanya hasil sampingan. Pada kenyataanya hanya 90-95% dari nilai ini yang dapat dicapai. Konsentrasi alkohol yang dihasilkan dalam fermentasi tergantung pada jenis khamir yang dipakai dan kadar gula. Sedangkan konsentrasi produk samping dipengaruhi oleh suhu, aerasi, kadar gula dan keasaman (Underkofler dan Hickey, 1954). Produk samping yang dihasilkan antara lain asam piruvat dan asam laktat.
Pada kondisi anaerob, metabolisme glukosa menjadi etanol terjadi melalui jalur Embden Meyerhoff-Parnas (Gambar 3) yang merupakan reaksi-reaksi fosforilasi dan defosforilasi dengan ATP dan ADP sebagai donor aseptor fosfat, reaksi pemecahan C6 menjadi 2 molekul C3 yang terfosforilasi, reaksi oksidasi-
reduksi dan reaksi dekarboksilasi. Gukosa mengalami fosforilasi menjadi glukosa-6-P dan fruktosa-6-P dengan ATP sebagai donor fosfat. Fruktosa-6-P kemudian dirubah menjadi fruktosa-1.6-di-P kemudian dipecah mencadi 2 molekul C3 yang terfosforilasi yaitu dihidroksiaseton fosfat dan gliseraldehida-3-
P. Dihidroksi aseton fosfat selanjutnya teroksidasi menjadi gliserol fosfat kemudian diubah menjadi gliserol yang merupakan metabolit sekunder. Gliseraldehid-3-P tereduksi membentuk asam 1.3-difosfogliserat kemudian mengalami difosforilasi menjadi 3-P-asam gliserat dengan melepaskan fosfat dan akseptor fosfat ADP membentuk ATP.
Gambar 3. Embden Selanjutnya, 3-P
terbentuk asam fosfoen gliseraldehid gliseraldehid
1,3-bifosfo g
3-fosfo gliserat 2-fosfo gliserat fosfo enol piruvat
piruvat
piruvat
dekarboksilase
Embden Meyerhoff-Parnas Pathway (Diwan, 2007 P-asam gliserat membentuk 2-P-asam gliserat fosfoenol piruvat dengan menghasilkan ATP. Melalui
Glukosa
glukosa-6-fosfat fruktosa-6-fosfat
fruktosa-1,6-bifosfat
liseraldehid-3-fosfat dihidroksi aseton fosfat liseraldehid-3-fosfat
bifosfo gliserat
gliserat gliserat fosfo enol piruvat
piruvat asetaldehid etanol heksokinase fosfoglukosa isomerase fosfofrukto kinase aldolase
triose fosfat isomerase
gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase fosfogliserat kinase fosfogliserat mutase enolase piruvat kinase piruvat dekarboksilase alkohol dehidrogenase 10 Diwan, 2007) liserat kemudian Melalui reaksi
11 dekarboksilasi, asam piruvat akan membentuk asetaldehid dan CO2 yang
kemudian akan mengalami reaksi oksidasi membentuk etanol.
Penambahan inokulum khamir dapat dilakukan dalam berbagai bentuk diantaranya dalam bentuk suspensi atau dalam bentuk kering. Banyaknya suspensi khamir yang ditambahkan dalam fermentasi skala besar sekitar 1-3% (Prescott dan Dunn, 1959), sedangkan Rinaldy (1987) menggunakan konsentrasi inokulum 10% (v/v).
Komposisi media untuk setiap mikroba berbeda satu sama lain. Zat makanan utama bagi pertumbuhan mikroba adalah sumber karbon, nitrogen, dan mineral terutama fosfat. Pertumbuhan mikrobial dipengaruhi oleh konsentrasi komponen penyusun media pertumbuhannya. Pasokan sumber karbon merupakan faktor yang sangat berpengaruh pada pertumbuhan optimal, tetapi pada kenyataanya konsentrasi sumber karbon mempunyai batas maksimum. Jika konsentrasi sumber karbon melampaui batas maka laju pertumbuhan akan terhambat (Casida, 1968).
Dalam fermentasi skala industri, sumber karbon yang biasa digunakan adalah karbohidrat yang diperoleh dari berbagai jenis pati seperti jagung, serealia, kentang, dan sagu. Sumber karbon lain juga bisa didapatkan dari hasil pertanian yang banyak mengandung selulosa antara lain jerami padi, tongkol jagung, bagas, limbah kayu, dan kertas. Sebelum digunakan, bahan-bahan tersebut harus dihidrolisis lebih dulu baik secara kimia maupun secara enzimatis (Hartoto, 1992). Sumber nitrogen yang dapat digunakan dalam proses fermentasi diantaranya corn step liqour, ekstrak gandum atau tauge, hidrolisat kasein, dan ekstrak khamir. Vogel (1983) membedakan sumber nitrogen menjadi sumber organik dan anorganik. Yang termasuk sumber nitrogen organik adalah corn step liqour, urea, protein, ekstak khamir dan tepung ikan. Sedangkan sumber nitrogen anorganik adalah amonia, amonium hidroksida dan amonium sulfat.
Menurut Hartoto (1992) sumber nitrogen yang biasa digunakan untuk fermentasi skala besar adalah garam amonium, urea atau amonia. Pemilihan amonium sebagai sumber nitrogen disebabkan oleh faktor ekonomis yaitu harga yang relatif murah dan mudah didapatkan seperti pupuk NPK dan ZA.
12