DAFTAR PUSTAKA
B. Sampling jaringan untuk reisolasi Prosedur kerjanya sebagai berikut:
1) Ikan dimatikan, bila sampel yang digunakan masih dalam keadaan hidup. 2) Permukaan kulit di lap dengan tisu untuk menghilangkan kotoran dan lender
yang berlebih, kemudian disemprot alkohol 70% dan dikeringkan dengan tisu sebagai sanitasi permukaan kulit yang akan dibedah.
3) Bagian ventral dari arah posterior menuju arah anus dipotong sedikit ke arah dorsal sejajar linea latelaris menggunakan gunting atau scapel steril.
4) Dengan pinset steril, daging ikan disibakkan dan dengan scapel steril, usus dan gelembung renang digeser sampai ginjal terlihat.
5) Dengan menggunakan loop tajam, dilakukan penusukkan ke dalam ginjal menembus membran pembungkus ginjal, lalu digoreskan secara aseptik ke media cawan BHIA. Hal ini dilakukkan dengan hati-hati jangan sampai loop mengenai organ lain. Satu cawan dapat dipakai untuk 3 sampel.
26 Lampiran 2. Komposisi media yang digunakan untuk kultur bakteri vaksin
A. Brain Heart Infusion Broth = 37 g/liter ≈ 3.7 g/100 ml Aquadest 1. Calf Brains, Infusion
2. Beef Hearts, Infusion 3. Proteose Pepton, Difco 4. Sodium Chloride 5. Disodium Phosphate 6. Bacto-Dextrose 7. pH 200 g 250 g 10 g 5 g 2.5 g 2 g 7.4
B. Phosphate Buffer Saline (PBS) = g/liter 1. NaCl 2. KH2PO4 3. Na2HPO4 4. KCl 5. Aquadest 6. pH 8 g 0.2 g 1.5 g 0.2 g 1000 ml 7.0 – 7.4
C. Larutan Neutral Buffer Formalin 3% 1. Na2HPO4
2. NaH2PO4.H20
3. Formaldehyde Solution min. 37%
0,195 g 0,12 g
27 Lampiran 3. Prosedur uji karakteristik biokimia bakteri (uji oksidatif/fermentatif, motilitas, oksidase, katalase, uji pertumbuhan dalam NaCl 6.5%, uji produksi asam dari D-manitol, dan uji hemolysis) dan sifat Gram.
A. Pewarnaan Gram
1. Gelas objek dibersihkan dari lemak dengan alkohol 70% dan diberi label. 2. Satu tetes akuades steril diteteskan pada permukaan gelas objek.
3. Isolat diambil dengan jarum ose steril, yang dicampur dengan akuades dan diulas merata pada permukaan gelas objek.
4. Dilakukan fiksasi dengan melewatkan preparat di atas api (jarak 15 cm) beberapa kali hingga terlihat kering.
5. Larutan crystal violet diteteskan pada preparat sampai merata dan didiamkan selama 1 menit.
6. Preparat dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
7. Larutan iodine lugol diteteskan pada preparat sampai merata dan didiamkan selama 1 menit
8. Preparat dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
9. Larutan alkohol aseton diteteskan pada preparat sampai merata dan didiamkan selama 3 detik
10. Preparat dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
11. Larutan safranin diteteskan pada preparat sampai merata dan didiamkan selama 30 detik. 12. Preparat dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
13. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x atau 1000x, dengan menggunakan minyak emersi
14. Sifat bakteri Gram positif ditandai dengan sel bakteri berwarna ungu dan sifat bakteri Gram negatif ditandai dengan sel bakteri berwarna merah.
B. Uji Motilitas
Prosedur kerja dalam uji motilitas, adalah sebagai berikut:
1. Penyiapan media: dilakukan dengan melarutkan 30 g bahan dalam 1 Liter aquadest, lalu dipanaskan di penangas hingga larut sempurna, kemudian dituang dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf 15 menit suhu 121oC tekanan 1 atm.
2. Cara melakukan uji: koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum inoculum, yang diinokulasikan secara vertical, kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam. 3. Hasil uji: motilitas bakteri diperlihatkan dengan adanya pertumbuhan pada permukaan
medium dan tidak hanya pada bekas tusukan, bakteri non motil tumbuh sempanjang tusukan, pembentukkan indol ditandai dengan timbulnya warna merah muda setelah penambahan 1-2 pereaksi Kovak atau Ehrlich, adanya pembebasan sulfida terlihat oleh terbentuknya warna hitam.
C. Uji Oksidatif/Fermentatif
Prosedur kerja dalam melakukan uji oxidative/fermentative adalah sebagai berikut:
1. Penyiapan media: dilakukan dengan melarutkan 9.4 g bahan dalam 1 Liter aquadest, lalu ditambahkan 10 g glukosa, setelah itu dipanaskan di penangas hingga larut sempurna, kemudian dituang dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf 15 menit suhu 121oC tekanan 1 atm.
2. Cara melakukan uji: koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose, yang diinokulasikan secara vertical pada 1 set O/F medium, salah satu tabung diberi paraffin cair 1 ml dan yang satu lagi tidak diberi paraffin. kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam.
3. Hasil pengujian: reaksi oksidatif bila tabung yang tidak diberi paraffin berubah menjadi kuning, sedangkan reaksi fermentatif bila tabung yang tidak diberi paraffin berubah warna menjadi kuning atau kedua tabung berubah warna menjadi kuning.
28 D. Uji Katalase
Cara melakukan uji katalase yaitu: sebagian koloni bakteri diambil dari agar miring dan diletakkan pada gelas objek, lalu diberikan larutan hydrogen peroksida pada koloni tersebut. Adanya gelembung-gelembung menunjukkan reaksi positif.
E. Uji Oksidase
Caranya yaitu: p-aminodimethylaniline-oxalat 1% diteteskan pada kertas saring. Kemudian 1 ose penuh biakan dari media padat diulaskan di atas tetesan p-aminodimethylaniline-oxalat. Bila koloni berubah warna menjadi merah atau merah muda, berarti tes positif, bila berwarna ungu berarti tes negatif.
F. Uji pertumbuhan dalam NaCl 6.5%
Prosedur kerja dalam melakukan uji pertumbuhan dalam NaCl 6.5% adalah sebagai berikut: 1. Penyiapan media: dilakukan dengan melarutkan 52 g BHIA dalam 1 Liter aquadest, lalu
ditambahkan 65 g NaCl, setelah itu dipanaskan di penangas hingga larut sempurna, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf 15 menit suhu 121oC tekanan 1 atm, setelah itu dituang dalam cawan petri hangat kuku sebanyak 12 mL dan diamkan.
2. Cara melakukan uji: koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose, yang diinokulasikan dengan menggoreskan pada media BHIA yang ditambahkan NaCl, kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam.
3. Hasil pengujian: reaksi positif apabila bakteri tumbuh pada media dan reaksi negatif apabila tidak tumbuh pada media.
G. Uji Hemolisis
Cara melakukan uji: isolat bakteri diinokulasikan ke dalam blood agar dengan metode cawan gores, inkubasi pada suhu 25oC-30oC selama 24 jam, kemudian diamati daerah yang terbentuk disekitar koloni yang tumbuh. Hasil yang didapatkan adalah reaksi positif alpha haemolisis jika terdapat zona kehijau-hijauan disekitar daerah koloni dan reaksi positif betha haemolisis jika terdapat zona bening disekitar daerah koloni. Reaksi negatif apabila tidak terjadi zona warna disekitar daerah koloni.
H. Uji produksi asam dari D-mannitol
Prosedur kerja dalam melakukan uji produksi asam dari D-mannitol adalah sebagai berikut: 1. Penyiapan media: dilakukan dengan melarutkan Phenol Red secukupnya ditambah
dengan 37 g BHIB dalam 1 Liter aquadest, setelah itu dipanaskan di penangas hingga larut sempurna, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf 15 menit suhu 121oC tekanan 1 atm, setelah itu ditambahkan 5-10 g/Liter manitol dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL.
2. Cara melakukan uji: koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum inokulum, yang diinokulasikan secara vertical, kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam. 3. Hasil pengujian: reaksi positif apabila terbentuk warna kuning pada media dan negatif
29 Lampiran 4. Hasil analisis statistik tingkat mortalitas dengan SAS
ANOVA
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F UT H10 5 6894.444444 1378.888889 62.05 <.0001 UT H20 5 5694.444444 1138.888889 44.57 <.0001
Uji Lanjut UT H10
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 63.333 3 K+ B 43.333 3 B B 36.667 3 C CB 33.333 3 A C 20.000 3 D D 0.000 3 K- Uji Lanjut UT H20
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 56.667 3 K+ B 36.667 3 B B 30.000 3 A CB 26.667 3 C CD 13.333 3 D D 0.000 3 K-
30 Lampiran 5. Hasil analisis statistik tingkat kelangsungan hidup relatif
dengan SAS
ANOVA
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F UT H10 3 2201.436130 733.812043 8.91 0.0125 UT H20 3 2832.407408 944.135803 14.64 0.0036
Uji Lanjut UT H10
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 68.254 3 D BA 47.619 3 A B 42.063 3 C B 30.952 3 B Uji Lanjut UT H20
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 76.667 3 D B 52.222 3 C B 46.667 3 A B 34.444 3 B
31 Lampiran 6. Hasil analisis statistik total eritrosit dengan SAS
ANOVA
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F H10 5 1.66297667 0.33259533 35.50 <.0001 H20 5 2.02714000 0.40542800 46.40 <.0001 H30 5 3.04661067 0.60932213 219.09 <.0001
Uji Lanjut H10
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 2.09100 5 D B 1.83600 5 A B 1.82400 5 C B 1.78900 5 B C 1.43100 5 K Uji Lanjut H20
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 2.03500 5 D A 1.93000 5 A B 1.71700 5 C B 1.69500 5 B C 1.41800 5 K- C 1.29700 5 K+ Uji Lanjut H30
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 2.30700 5 D B 1.94500 5 A B 1.91300 5 C C 1.80100 5 B D 1.48160 5 K- E 1.33400 5 K+
32 Lampiran 7. Hasil analisis statistik total leukosit dengan SAS
ANOVA
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F H10 5 45.25218667 9.05043733 9.81 <.0001 H20 5 109.4120567 21.8824113 24.93 <.0001 H30 5 148.9233067 29.7846613 57.47 <.0001
Uji Lanjut H10
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 11.1600 5 D BA 10.3360 5 A BA 10.1200 5 C BC 9.1280 5 B C 7.9020 5 K Uji Lanjut H20
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 13.8300 5 D A 12.8520 5 A BA 12.3880 5 C BC 10.7700 5 B C 10.1200 5 K+ D 8.1020 5 K- Uji Lanjut H30
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 16.0500 5 D B 14.1780 5 C CB 13.4300 5 A CD 12.3360 5 B D 11.2520 5 K+ E 9.0100 5 K-
33 Lampiran 8. Hasil analisis statistik titer antibodi dengan SAS
ANOVA
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F H10 5 36.26666667 7.25333333 70.19 <.0001 H20 5 100.6666667 20.1333333 57.52 <.0001 H30 5 118.5666667 23.7133333 65.27 <.0001
Uji Lanjut H10
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 2.6000 5 D A 2.4000 5 A A 2.2000 5 C A 2.0000 5 B B 0.0000 5 K Uji Lanjut H20
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 5.0000 5 D B 3.8000 5 A B 3.6000 5 C B 3.2000 5 B C 0.4000 5 K+ C 0.0000 5 K- Uji Lanjut H30
Tukey Grouping Mean N Perlakuan A 5.6000 5 D B 4.4000 5 C B 4.0000 5 A B 3.4000 5 B C 0.8000 5 K+ C 0.0000 5 K-