5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.2 Saran
1. Diperlukan penelitian lain yang membandingkan antara respon imun adaptif selular Wuchereria bancrofti pada ibu hamil dan ibu tidak hamil. 2. Penelitian lebih lanjut mengenai respon imun adaptif selular pada setiap
fase perjalanan penyakit filariasis pada ibu hamil.
40
DAFTAR PUSTAKA
1. Nwoke BEB, Nwoke EA, Ukaga CN, Nwachukw MI. Epidemiological Characteristics of Bancroftian filariasis and the Nigerian Environment. Journal of Public Health and Epidemiology. 2010; 2(6):113-117.
2. Bhullar N, Maikere J. Challenges in Mass Drug Administration for Treating Lymphatic Filariasis in Papua, Indonesia. Parasit Vectors. 2010;3:70.
3. Pani SP, Kumaraswami V, Das LK. Epidemiology of Lymphatic Filariasis with Special Reference to Urogenital - Manifestations. Indian J Urol. 2005;21:44-9.
4. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Rencana Nasional Program Akselerasi Eliminiasi Filariasis di Indonesia 2010 - 2014. Jakarta: Kementerian Kesehatan Republik Indonesia; 2010
5. Santoso, Ambarita LP, Oktarina R, Sudomo M. Epidemiologi Filariasis di Desa Sungai Rengit Kecamatan Talang Kelapa Kabupaten Banyuasin Tahun 2006. Buletin Penelitian Kesehatan [Internet]. 2008 [cited 2011 May 10]: 36(2). Available from: http://www.litbang.depkes.go.id/~djunaedi/ documentation/360208pdf/santoso.pdf
6. World Health Organization. Lymphatic Filariasis : Epidemiology [Internet].
c2012. [cited 2011 May 19]. Available from:
http://www.who.int/lymphatic_filariasis/epidemiology/en/
7. Sudomo M, Chayabejara S, Duong S, Hernandez L, Wu WP, Bergguist R. Elimination of Lymphatic Filariasis in Southeast Asia. Adv Parasitol. 2010; 72: 205-33.
8. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Penderita Filariasis Tersebar di 386 Kabupaten/Kota [Internet]. [cited 2011 May 19]. Available from:
http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release/453-penderita-filariasis-tersebar-di-386-kabupatenkota.html
9. Abbas AK, Lichtman AH. Cell Mediated Immune Responses. In: Basic Immunology: Functions and Disorders of the Immune System. 3rd ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; 2009. P. 104 - 7
Universitas Indonesia
10. Babu S, Blauvelt CP, Kumaraswami V, Nutman TB. Cutting Edge: Diminished T Cell TLR Expression and Function Modulates the Immune Response in Human Filarial Infection. J Immunol. 2006; 176 (7):3885 – 9. 11. Mor G, Cardenas I. The Immune System in Pregnancy: A Unique Complexity.
Am J Reprod Immunol. 2010; 63(6): 425–433.
12. Alamsyah BA. Perbandingan Titer IgE pada Penduduk yang Terinfeksi Filaria dan Penduduk Atopi di Daerah Endemis Kecacingan [Script]. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.
13. Kamus Kedokteran Dorland. 29th
ed. Jakarta: EGC; 2002. Filariasis. P.834. 14. Centers for Diseases Control and Prevention. Parasites – Lymphatic Filariasis
[Internet]. Atlanta (USA): Centers for Disease Control and Prevention; c2011 [updated 2010 Nov 12; cited 2011 May 19]. Available from: http://www.cdc.gov/parasites/lymphaticfilariasis/epi.html
15. Roberts LS, Janovy jr J.Nematodes: Filaroidea, Filarial Worms.In: Gerald D Schmmidt & Larry S Robert’s Foundations of Parasitology, 7th
ed. Boston: McGraw-Hill; 2006. P. 461 – 6.
16. Centers for Diseases Control and Prevention. Filariasis [Internet]. [updated 2009 Jul 20; cited 2011 May 19]. Available from :
http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/frames/a-f/filariasis/body_Filariasis_w_bancrofti.htm
17. Nutman TB, Weller PF. Filarial and Related Infections. In: Kasper DL, et al [ed.]. Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16th ed. New York: McGraw – Hill; 2005. p.1260 – 3.
18. Wayangankar S. Filariasis Treatment & Management [Internet]. c1994 – 2012. [updated 2012 May 30; cited 2012 Jun 3 ]. Available from : http://emedicine.medscape.com/article/217776-clinical
19. Palumbo E. Filariasis : Diagnosis, Treatment, and Prevention. ACTA BIOMED. 2008; 79: 109 – 9.
20. Mendoza N, Li A, Gill A, Tyring S. Filariasis: Diagnosis and Treatment. Dermatol Ther. 2009; 22(6):475-90.
42
Universitas Indonesia
21. Shah AP, Mulla SA. Circulating Filarial Antigen in Serum and Hydrocele Fluid from Individuals Living in an Endemic Area for Bancroftian Filariasis. Indian J Med Microbiol. 2007; 25(3):253-5.
22. Rocha A, et al. Comparison of Tests for the Detection of Circulating Filarial Antigen (Og4C3-ELISA and AD12-ICT) and Ultrasound in Diagnosis of Lymphatic Filariasis in Individuals with Microfilariae. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104(4):621-5.
23. Nuchprayoon S. DNA-based Diagnosis of Lymphatic Filariasis. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009;40(5):904-13.
24. Weil GJ, et al. A Multicenter Evaluation of a New Antibody Test Kit for Lymphatic Filariasis Employing Recombinant Brugia malayi Antigen Bm-14. Acta Trop. 2011; 120 (1): S19-22.
25. Hoti SL, et al. A Method for Detecting Microfilaraemia, Filarial Specific Antigens and Antibodies and Typing of Parasites for Drug Resistance and Genotypes Using Finger Prick Blood Sample. Acta Trop. 2008; 107(3):268-71.
26. Baratawidjaja K, Rengganis I. Imunologi Dasar. 9th
ed. Jakarta: Balai Penerbit FKUI; 2010. P. 40. 112 – 26. 433 – 40.
27. Babu S, Blauvelt CP, Kumaraswami V, Nutman TB. Regulatory Networks Induced by Live Parasites Impair Both Th1 and Th2 Pathways in Patent Lymphatic Filariasis: Implications for Parasite Persistence. J Immunol. 2006; 176 (5): 3248 – 56.
28. Taylor MD, et al. CTLA-4 and CD4+
CD25+ Regulatory T Cells Inhibit Protective Immunity to Filarial Parasites In Vivo. J Immunol. 2007; 179 (7): 4626 – 34.
29. Babu S, Blauvelt CP, Kumaraswami V, Nutman TB. Diminished Expression and Function of TLR in Lymphatic Filariasis: A Novel Mechanism of Immune Dysregulation. J Immunol. 2005;175 (2): 1170 – 6.
30. Putri DF. Penurunan IgG4 Anti Filaria dengan Bm14-ELISA pada Penduduk di Daerah Endemis Filariasis Brugia timori setelah Pengobatan Massal DES – Albendazol [Thesis]. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2009.
Universitas Indonesia
31. Wibowo H, et al. Cytokine and Total IgE Responses in Pregnant Women Living in Helminth Endemic Area in Bekasi Distric, Indonesia. Trans R Soc Trop Med Hyg [submitted].
Lampiran : Cara Kerja Penelitian Utama CARA KERJA31
1. Pengambilan sediaan a. Kuesioner
Kuesioner untuk mengetahui informasi dari ibu hamil mengenai, umur riwayat kehamilan, riwayat penyakit, riwayat tempat tinggal, dan status sosial ekonomi.
b. Sediaan tinja ibu hamil
Sediaan tinja diambil dari ibu pada usia kehamilan 34 minggu. Sediaan diambil menggunakan batang kayu (ice cream stick) sebanyak +1 gram tinja. Sediaan dimasukkan kedalam tabung plastik yang telah diberi 1 cc formalin 10 %. Perlakuan Kultur Darah + Stimulasi BmA Mikroskopik Filtrasi dan ICT ELISA dan Luminex Ibu Hamil Ibu Hamil Infeksi Wuchereria bancrofti (+) Ibu Hamil Sehat Analisis Sediaan Kadar IFN γ Kadar IL - 5 Analisis Sediaan Kadar IFN γ Kadar IL-5 Sediaan Kuesioner Darah Tinja Pencarian Sampel Kultur Darah ELISA dan Luminex Perlakuan pada Penelitian Utama
Sediaan darah di ambil dari ibu pada usia kehamilan 34 minggu. Sediaan diambil dengan menggunakan syringe, sebanyak 5 ml darah vena diambil pada malam hari (pada pukul 20.00-21.00) dan dimasukkan kedalam tabung vacutainer yang mengandung antikoagulan heparin. Sediaan kemudian dikirim ke laboratorium. Sediaan dibagi menjadi 1 ml darah digunakan untuk pemeriksaan filaria berdasarkan teknik filtrasi; 2 ml darah digunakan untuk kultur; dan 2 ml darah diendapkan untuk diambil plasma.
2. Analisa Sediaan
2.1.Penetapan Status Infeksi Parasit pada Ibu Hamil
2.1.1 Status Infeksi Parasit Usus berdasarkan Pemeriksaan Sediaan Tinja
Sampel tinja disimpan dalam tabung yang mengandung formalin 10%. Pemeriksaan secara mikroskopik untuk menemukan adanya infeksi parasit dalam usus. Status infeksi cacing usus ditetapkan dengan ditemukannya telur.
2.1.2 Status Infeksi Parasit Jaringan (Wuchereria bancrofti)
berdasarkan Pemeriksaan Sediaan Darah
Status infeksi Wuchereria bancrofti ditetapkan berdasarkan 2 metode, berdasarkan adanya mikrofilaria dalam darah dengan filtrasi dan antigen berdasarkan teknik ICT.
a. Deteksi mikrofilaria berdasarkan teknik filtrasi
Pemeriksaan mikrofilaria dengan teknik filtrasi. Pemeriksaan ini menggunakan siring 1 ml. Filtrasi dilakukan dengan menyaring darah menggunakan membran Millipore® yang berdiameter pori 5m. Membran kemudian dikeringkan dan dilanjutkan dengan fiksasi dengan meneteskan metanol pada
membran. Setelah membran kering, kemudian dilakukan pewarnaan Giemsa. Keberadaan mikrofilaria kemudian diperiksa menggunakan mikroskop
b. Deteksi antigen filaria Wuchereria bancrofti berdasarkan teknik Immunochromatography test (ICT)
Pemeriksaan antigen filaria menggunakan metode ICT seperti yang telah digambarkan oleh produsen (Binnax, USA), 50 μl plasma diteteskan pada tatakan absorban, plasma kemudian bergerak melalui tangkai yang telah mengandung sepasang poliklonal dan monokonal antibodi yang akan berikatan dengan antigen filaria pada darah atau plasma seseorang yang terinfeksi filaria. Setelah 15 menit kemudian uji dibaca sesuai instruksi dari produsen, yaitu adanya garis pada area T (test area) maka sampel yang di uji positif tersebut mengandung antigen filaria. Sampel dinyatakan positif jika garis yang tertera pada area T lebih tipis atau lebih tebal dari garis yang terdapat pada area kontrol (Area C).
2.2 Analisa Respon Imun pada Ibu Hamil a. Kultur darah (whole blood culture)
Kultur darah dilakukan untuk melihat respon sitokin tehadap antigen filaria (BmA; Brugian malayi Adult worm) dan kontrol (medium). Sediaan 1 ml darah diencerkan 5 kali dengan menambahkan 4 ml RPMI. Sebagai media kultur RPMI, sebelumnya telah ditambahkan antibiotik (natrium penicillin, streptomycine) dan pyruvate-glutamate. Kemudian 100 µl darah yang telah diencerkan dimasukkan kedalam setiap sumur pada plate kultur (Nunc, Roskilde Plates). Kultur pada sumur plate dilakukan duplo untuk tiap jenis antigen. Stimulasi dilakukan dengan menambahkan 100 µl antigen BmA (konsentrasi 12.5
ulangan dilakukan pada masing-masing plate yang berbeda. Kemudian
plate kultur dimasukkan ke dalam inkubator (5% CO2 dan 370C). Kultur pada plate pertama diinkubasi selama 1x24 jam, dan kultur pada plate kedua diinkubasi selama 6x24. Kemudian sitokin hasil kultur diambil dari supernatan. Kemudian supernatan untuk pengukuran IL-10 dan TNF dilakukan dari plate kultur yang diinkubasi selama 1x24 jam. Sedangkan, pengukuran IL5, IL13, IFN-γ dilakukan dari plate kultur yang diinkubasi selama 6x24 jam. Pengukuran kadar semua sitokin diukur secara simultan dengan Luminex, kecuali untuk IL - 5. Pengukuran kadar IL-5 akan diukur terpisah dengan ELISA.
b. Pengukuran sitokin berdasarkan Luminex (bead based multiplex
cytokine assay)
Kadar IL-10 dan TNF- dalam supernatan kultur darah 1x24 jam diukur secara simultan, sedangkan kadar IL-13 dan IFN-γ dalam supernatan kultur darah 6x24 jam. Bead yang digunakan dengan diameter 5 µm sebagai pengganti solid phase pada metode ELISA, sebelumnya dilapisi dengan antibodi anti sitokin. Pada setiap macam sitokin digunakan bead dengan fluoresensi yang berbeda-beda. Setelah proses pelapisan, kemudian jumlah bead dihitung dengan kamar hitung untuk mendapatkan konsentrasi bead per ml. Kemudian supernatan diletakkan pada sumur round-bottomed plate kultur (Nunc, Roskilde
Plates) dan ditambahkan buffer HPE untuk pengenceran dua kali.
Kemudian campuran standard sitokin (IL-10 & IFN-γ: CLB-Sanquin, TNF-: Biosource, IL-13: NIBSC) dipersiapkan dan diengencerkan tiga kali secara bertingkat, kemudian diletakkan pada sumur. Kemudian campuran bead dan biotinylated antibody (CLB-Sanquin) anti sitokin dipersiapkan dan diteteskan ke dalam setiap sumur yang telah berisi supernatan atau standar sitokin. Kemudian plate kultur yang telah diisi dibungkus dengan kertas aluminium. Hal ini dilakukan karena bead
sensitif terhadap cahaya. Kemudian plate kultur diletakkan pada shaker dan diinkubasi semalaman pada suhu ruangan. Kemudian dilajutkan dengan sentrifugasi pada plate dan cairan dibuang, lalu ditambahkan larutan PBS-Tween 0.05%. Pencucian dilakukan dua kali dan kemudian ditambahkan streptavidine phyco-erythrine (yang diencerkan 25 kali). Selanjutnya plate kultur dibungkus dengan kertas aluminium kembali, diletakkan pada shaker, dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan. Kemudian plate kultur dicuci sekali dengan PBS-Tween 0.05%. Kemudian pengukuran mean fluorescence intensity dari masing-masing sitokin dilakukan dengan menggunakan mesin Luminex IS100.
1. Sebaran Data Kadar IFN - γ dan IL – 5 pada Plasma
Case Processing Summary
ICT positivity
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent mother IFNg
control day 6
positive 26 70.3% 11 29.7% 37 100.0% negative 37 66.1% 19 33.9% 56 100.0% mother IL5 control
day 6
positive 26 70.3% 11 29.7% 37 100.0% negative 37 66.1% 19 33.9% 56 100.0%
Descriptives
ICT positivity Statistic Std. Error
mother IFNg control day 6
positive Mean 8.819307E0 2.4568169E0
95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 3.759397E0 Upper
Bound 1.387922E1 5% Trimmed Mean 6.997870E0
Median 3.298800E0 Variance 156.935 Std. Deviation 1.2527357E1 Minimum 1.4000 Maximum 53.4155 Range 52.0155 Interquartile Range 9.5503 Skewness 2.361 .456 Kurtosis 5.944 .887
e 95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 1.142621E0 Upper
Bound 1.105880E1 5% Trimmed Mean 3.184265E0
Median 1.400000E0 Variance 221.133 Std. Deviation 1.4870549E1 Minimum 1.4000 Maximum 80.0652 Range 78.6652 Interquartile Range .0000 Skewness 4.109 .388 Kurtosis 18.219 .759
mother IL5 control day 6
positive Mean 6.212069E0 1.3002012E0
95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 3.534255E0 Upper
Bound 8.889884E0 5% Trimmed Mean 5.351385E0
Median 3.734600E0 Variance 43.954 Std. Deviation 6.6297514E0 Minimum 1.4000 Maximum 29.5070 Range 28.1070 Interquartile Range 7.4925 Skewness 2.040 .456 Kurtosis 5.051 .887 negativ e
Mean 4.552811E0 1.5881025E0
95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 1.331990E0 Upper
Variance 93.317 Std. Deviation 9.6600506E0 Minimum 1.4000 Maximum 57.0670 Range 55.6670 Interquartile Range 1.0018 Skewness 4.797 .388 Kurtosis 25.543 .759
2. Test Uji Distribusi Normal IFN - γ dan IL – 5 pada Plasma
Tests of Normality
ICT positivity
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. mother IL5 control
day 6 dimension1
positive .234 26 .001 .751 26 .000
negative .372 37 .000 .367 37 .000
mother IFNg
control day 6 dimension1
positive .280 26 .000 .660 26 .000
negative .443 37 .000 .368 37 .000
a. Lilliefors Significance Correction
3. Uji Nonparametrik Mann – Whitney untuk Kadar IFN - γ dan IL – 5 Plasma antara Ibu Hamil Terinfeksi dengan Ibu Hamil Sehat
Test Statisticsa mother IFNg control day 6 mother IL5 control day 6 Mann-Whitney U 326.000 324.000 Wilcoxon W 1029.000 1027.000 Z -2.579 -2.430
Asymp. Sig. (2-tailed) .010 .015
4. Uji Nonparametrik Wilcoxon untuk Kadar IFN - γ dan IL – 5 Plasma Ibu Hamil Terinfeksi Filaria
Test Statisticsb,c mother IL5 control day 6 - mother IFNg control day 6 Z -.698a
Asymp. Sig. (2-tailed) .485 a. Based on positive ranks.
b. ICT positivity = positive c. Wilcoxon Signed Ranks Test
5. Sebaran Data Kadar IFN - γ dan IL – 5 pada Stimulasi BmA
Case Processing Summary
ICT positivity
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent mother IFNg
BmA day 6
positive 26 70.3% 11 29.7% 37 100.0% negative 37 66.1% 19 33.9% 56 100.0% mother IL5 BmA
day 6
positive 26 70.3% 11 29.7% 37 100.0% negative 37 66.1% 19 33.9% 56 100.0%
Descriptives
ICT positivity Statistic Std. Error
mother IFNg BmA day 6
positive Mean 2.424479E1 8.0041020E0
95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 7.760038E0 Upper
Bound 4.072955E1 5% Trimmed Mean 1.850926E1
Minimum 1.4000 Maximum 1.5295E2 Range 1.5155E2 Interquartile Range 27.7058 Skewness 2.449 .456 Kurtosis 5.450 .887 negativ e
Mean 7.024484E1 2.1037926E1
95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 2.757795E1 Upper
Bound 1.129117E2 5% Trimmed Mean 5.072885E1
Median 2.822450E1 Variance 1.638E4 Std. Deviation 1.2796871E2 Minimum 1.4000 Maximum 7.3129E2 Range 7.2989E2 Interquartile Range 86.1001 Skewness 4.086 .388 Kurtosis 20.257 .759
mother IL5 BmA day 6
positive Mean 5.612378E2 1.8892032E2
95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 1.721491E2 Upper
Bound 9.503265E2 5% Trimmed Mean 4.138684E2
Median 2.329500E2
Variance 9.280E5
Std. Deviation 9.6330839E2
Maximum 4.0000E3
Range 3.9945E3
Interquartile Range 4.3196E2
Skewness 2.743 .456
Kurtosis 7.251 .887
negativ e
Mean 3.102088E2 9.1146779E1
95% Confidence Interval for Mean
Lower
Bound 1.253546E2 Upper
Bound 4.950631E2 5% Trimmed Mean 2.279953E2
Median 8.005800E1 Variance 3.074E5 Std. Deviation 5.5442421E2 Minimum 1.4000 Maximum 3.0000E3 Range 2.9986E3
Interquartile Range 4.4805E2
Skewness 3.475 .388
Kurtosis 15.236 .759
6. Test Uji Distribusi Normal IFN - γ dan IL – 5 pada Stimulasi BmA
Tests of Normality
ICT positivity
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic df Sig. mother IL5 BmA
day 6 dimension1 positiv e .340 26 .000 .577 26 .000 negativ e .289 37 .000 .586 37 .000
mother IFNg BmA day 6 dimension1 positiv e .288 26 .000 .606 26 .000 negativ e .295 37 .000 .537 37 .000
positivity Statistic df Sig. Statistic df Sig. mother IL5 BmA
day 6 dimension1 positiv e .340 26 .000 .577 26 .000 negativ e .289 37 .000 .586 37 .000
mother IFNg BmA day 6 dimension1 positiv e .288 26 .000 .606 26 .000 negativ e .295 37 .000 .537 37 .000
a. Lilliefors Significance Correction
7. Uji Nonparametrik Mann – Whitney untuk Kadar IFN - γ dan IL – 5 Darah dengan Stimulasi BmA antara Ibu Hamil Terinfeksi dengan Ibu Hamil Sehat
Test Statisticsa
mother IFNg BmA day 6
mother IL5 BmA day 6
Mann-Whitney U 354.000 358.500
Wilcoxon W 705.000 1061.500
Z -1.812 -1.710
Asymp. Sig. (2-tailed) .070 .087
a. Grouping Variable: ICT positivity
8. Uji Nonparametrik Wilcoxon untuk Kadar IFN - γ dan IL – 5 pada Darah Ibu Hamil dengan Stimulasi BmA
Test Statisticsb,c
mother IFNg BmA day 6 - mother IL5 BmA
day 6
Z -4.407a
Asymp. Sig. (2-tailed) .000 a. Based on positive ranks.
b. ICT positivity = positive c. Wilcoxon Signed Ranks Test
Test Statisticsb,c
mother IFNg BmA day 6 - mother IL5 BmA
day 6
Z -2.834a
Asymp. Sig. (2-tailed) .005 a. Based on positive ranks.
b. ICT positivity = negative c. Wilcoxon Signed Ranks Test
9. Uji Nonparametrik Wilcoxon untuk Kadar IFN – γ Sebelum dan Setelah Stimulasi BmA Test Statisticsb mother IFNg BmA day 6 - mother IFNg control day 6 Z -4.649a
Asymp. Sig. (2-tailed) .000 a. Based on negative ranks.
b. Wilcoxon Signed Ranks Test
10. Uji Nonparametrik Wilcoxon untuk Kadar IL – 5 Darah Sebelum dan Setelah Stimulasi BmA
Test Statisticsb,c
mother IL5 BmA day 6 - mother IL5 control day 6
mother IFNg BmA day 6 - mother IFNg control day 6
Z -4.457a -1.303a
c. Wilcoxon Signed Ranks Test
Test Statisticsb,c
mother IL5 BmA day 6 - mother IL5 control day 6
mother IFNg BmA day 6 - mother IFNg control day 6
Z -4.976a -4.345a
Asymp. Sig. (2-tailed) .000 .000
a. Based on negative ranks. b. ICT positivity = negative c. Wilcoxon Signed Ranks Test