BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
E. Uji Sitotoksisitas
2. Sel Vero
Sel Vero digunakan dalam kultur sel. Sel Vero adalah sel garis keturunan Vero, diperoleh dari sel epitelial ginjal dari monyet hijau Afrika (Cercopithecus
aethiops). Garis keturunan Vero diisolasi pada 27 Maret 1962, oleh Yasumura dan
Kawakita di Universitas Chiba, Jepang. Sel Vero digunakan dalam kultur sel untuk banyak tujuan yaitu skrining untuk toksin E.coli (Verotoxin) dan sebagai sel host untuk tumbuhnya virus (Anonim, 2006 d).
3. Sel SiHa
Menurut Sofian, ginekolog RS Cipto Mangunkusumo, 90% kasus kanker leher rahim diduga kuat akibat virus yang bernama Human Papilloma Virus (HPV) yang ditemukan pada tahun 1990, khususnya tipe 16 dan 18. Sel SiHa adalah salah satu bentuk tumor serviks. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel jaringan primer dari suatu karsinoma serviks dan merupakan squamosa yang tidak terdiferensiasi. Sel SiHa diperoleh dari karsinoma serviks yang diambil melalui pembedahan, mempunyai satu atau dua salinan DNA HPV-16 pada kromosom 13. Oleh karena pengaturan virus DNA yang sederhana, sel SiHa semakin sering
digunakan sebagai model sel karsinoma serviks dalam kerja penelitian (Ishibashi, 2006).
Medium pertumbuhan dari sel SiHa menggunakan medium RPMI (Rosswell Park Memorial Institute) 1640 ditambah dengan 2mM L-Glutamine dan
10% Foetal Bovine Serum (FBS). Medium ini dapat memelihara antara 3-9 x 105
sel/ml. Medium RPMI 1640-serum mengandung nutrisi yang dibutuhkan sel seperti asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa serta dilengkapi dengan serum yaitu suatu hormon yang akan memacu pertumbuhan sel. Seluruh komponen dalam medium RPMI 1640-serum berguna untuk memberikan nutrisi yang cukup pada sel supaya sel dapat bertahan hidup dan dapat memperbanyak diri. Medium pertumbuhan untuk sel Vero menggunakan medium M199 (Freshney, 1986). Komposisi medium RPMI 1640 dan M199 dapat dilihat pada Lampiran 7.
E. Sitotoksisitas
Sitotoksisitas ialah sifat toksis/beracun suatu senyawa terhadap sel hidup. Uji sitotoksisitas ialah suatu uji yang secara in vitro menggunakan kultur sel dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun bahan-bahan kimia lainnya. Uji ini selain menggunakan kultur sel juga menggunakan primer kultur dan juga studi farmakokinetika in vitro untuk mengembangkan obat-obat terapetik dan mengamati toksisitas baik akut maupun kronik (Freshney, 1986).
Penggunaan uji sitotoksisitas pada kultur sel merupakan uji kualitatif dan kuantitatif dengan cara menetapkan jumlah sel. Penetapan jumlah sel dapat
dilakukan dengan berbagai metode penunjuk viabilitas atau penunjuk toksisitas yang seringkali didasarkan pada parameter kerusakan membran, perubahan kemampuan metabolisme serta perubahan morfologi sel (Snell & Mullock, 1987). Uji sitotoksik untuk uji aktivitas antineoplastik menunjukkan adanya perbedaan respon dari populasi sel kanker yang berbeda dan respon yang diberikan oleh sel kanker lebih besar daripada sel normal (Freshney, 1986).
Sejumlah metoda telah dikembangkan untuk mempelajari kelangsungan hidup sel (viabilitas) dan perkembangbiakan (proliferasi) dalam populasi sel. Pengujian modern yang sederhana telah dikembangkan yaitu suatu bentuk
microplate (96-well plate). Uji sitotoksisitas dengan cara ini ekonomis dan mudah
perlakuannya, serta dapat dilihat mata dengan baik. Piringan 96 sumuran (96-well
plate), masing-masing sumuran mempunyai luas 28-32 mm2 dan kapasitas untuk
0,1-0,2 ml media dan 5.104–1.105 sel. Mikrotitrasi memberikan suatu metode uji sitotoksisitas terhadap sampel dalam jumlah yang banyak (Freshney, 2000 cit., Widyastuti, 2000).
Salah satu metode penunjuk sitotoksisitas adalah dengan pengujian secara kolorimetri. Satu parameter yang digunakan sebagai dasar pengujian secara kolorimetri adalah aktivitas metabolisme pada sel hidup. Sebagai contoh, pengujian dengan microtiter plate metode MTT [
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] dimana terbukti lebih akurat dan menghemat waktu
dibandingkan hitungan konvensional hemositotometer. Uji MTT untuk pertama kali diuraikan oleh Mosmann pada tahun 1983, didasarkan pada kemampuan enzim mitokondria dehidrogenase dari sel hidup untuk memecah cincin
tetrazolium pada MTT yang berwarna kuning pucat dan membentuk kristal formazan berwarna ungu yang tidak dapat keluar menembus membran sel, sehingga terakumulasi dalam sel hidup (Mosmann, 1983).
NH N N N S N CH3 CH3 Formazan NADH NAD+ N N N N S N CH3 H3C MTT Br
Gambar 6. Struktur molekul dari MTT dan hasil reduksinya
Setelah inkubasi sel dengan MTT kira-kira 2-4 jam, ditambahkan larutan deterjen ke sel lisis dan melarutkan kristal berwarna. Warna ungu formazan harus kelihatan di dalam sel sebelum larutan deterjen dapat ditambahkan. Jumlah sel yang masih hidup berbanding lurus dengan kadar formazan yang terbentuk. Warna kemudian dapat diukur secara kolorimetri. Hasil dibaca dengan menggunakan ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) reader pada panjang gelombang 570 nm (absorbansi maksimum). Intensitas warna yang dihasilkan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup (Anonim, 2006 e).
Metode lain yang juga dapat digunakan dalam penilaian sitotoksisitas antara lain :
1. Metode neutral red uptake
Metode ini menggunakan neutral red dye, yang secara khusus diserap dan terakumulasi ke dalam lisosom sel hidup. Absorbansi dibaca pada 540 nm dengan
dengan jumlah sel hidup. Kekurangan pada metode ini adalah pengendapan dye berbentuk kristal seperti jarum, halus, dan terlihat jelas. Metode ini sangat sederhana, cepat, sensitif, dan ekonomis (Barile, 1997).
2. Metode trypan blue
Trypan blue pertama kali disintesis tahun 1890 oleh ahli kimia di Jerman.
. Gambar 7. Struktur trypan blue
Trypan blue, suatu noda khusus yang mewarnai jaringan mati atau sel
menjadi biru. Ini merupakan diazo dye. Tes dengan trypan blue secara kualitatif dan menandai hanya jika suatu sel dalam keadaan hidup serta hasil dibaca dengan individual. Sel atau jaringan hidup dengan membran sel tetap utuh tidak akan diwarnai. Karena sel sangat selektif pada senyawa yang menembus membran, dalam sel hidup trypan blue tidak diserap. Karenanya, sel mati ditunjukkan sebagai warna biru yang membedakan di bawah mikroskop (Anonim, 2006 f).
3. Aktivitas LDH (Lactate Dehidrogenase)
Metode ini berdasarkan konsep bahwa sel yang mati melepaskan LDH ke dalam medium yang dapat diukur dengan metode spektrofotometri. Metode ini mengukur secara kuantitatif viabilitas sel yang hilang dan merespon viabilitas sel, bukan metabolisme sel. Masalah yang ditimbulkan adalah stabilisasi LDH
bervariasi tergantung tipe sel dan pelepasannya dari sel yang bervariasi tergantung besarnya kerusakan membran untuk melisis sel (Doyle and Griffiths, 2000).
F. Keterangan Empiris
Penelitian ini bersifat eksploratif untuk mengetahui hubungan empiris antara pengaruh pemberian fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80 terhadap kultur sel SiHa dan sel Vero.
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitiansitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80
terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.
B. Variabel-Variabel Penelitian 1. Variabel bebas
Kadar fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80 yaitu 4000 μg/ml ; 2000 μg/ml ; 1000 μg/ml ; 500 μg/ml ; 250 μg/ml ; dan 125 μg/ml.
2. Variabel tergantung
Prosentase kematian sel SiHa dan sel Vero. 3. Variabel pengacau terkendali
a. tempat tumbuh dan waktu pemanenan umbi teki dikendalikan dengan mengambil umbi pada tempat dan waktu yang sama
b. medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640 yang mengandung FBS 10% (sel SiHa) dan M199 (sel Vero)
c. pH serta suhu pembuatan dan penyimpanan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu ± 4oC
4. Variabel pengacau tak terkendali
Kematian alami sel SiHa dan Vero dan umur tumbuhan rumput teki.
5. Definisi operasional
a. Sitotoksisitas ialah uji toksisitas secara in vitro terhadap sel SiHa dan sel Vero dengan metode MTT.
b. Fraksi protein (FP20, FP40, FP60, FP80) ialah bagian dari tanaman yang berisi protein yang diperoleh dari hasil pengendapan secara bertingkat dengan garam amonium sulfat pada derajat kejenuhan 20%, 40%, 60%, 80%.
c. LC50 ialah konsentrasi fraksi protein umbi teki yang dapat membunuh sebesar 50% sel uji.
d. Sel SiHa adalah subjek uji (sel kanker) dalam uji sitotoksisitas. e. Sel Vero adalah pembanding (sel normal) dalam uji sitotoksisitas.
C. Alat dan Bahan 1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara lain: alat-alat gelas, stamper, mortir, timbangan analitik (AND ER-400 H), alumunium foil, magnetic
stirrer, tabung conical, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge
(PLC), inkubator (Memmer), mikropipet, membran dialisis (Sigma), cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV (Cecil CE-292), ELISA
reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Nuaire), mikroskop (Olympus IMT-2),
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. Sampel umbi teki
b. Kultur sel SiHa dan sel Vero yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
c. Pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi fraksi protein umbi teki : larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 ; larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl ; amonium sulfat p.a. (Merck)
d. Pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas
Medium pencuci : RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes ; medium penumbuh : RPMI 1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco) ; reagen stopper : SDS (Sodium Dodesil Sulfat) dalam HCl 0,01 N ; MTT [
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (Sigma) ; bahan untuk isolasi sel SiHa
dan sel Vero: tripsin 0,25%
D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu umbi teki (Cyperus
rotundus L.), telah diidentifikasi dan determinasi terlebih dahulu di laboratorium
Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan juga dipastikan kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen van den Brink, 1965).
2. Pengumpulan umbi teki
Umbi teki yang digunakan diambil dari Bandelan, Sumberarum, Moyudan, Sleman (tepi Sungai Progo), pada bulan Juli 2006.
3. Sterilisasi alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Alat-alat dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C (Anonim, 1995). 4. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh
a. Pembuatan medium pencuci
RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, lalu disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 μm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989). b. Pembuatan medium kultur (RPMI 1640-serum)
Untuk medium RPMI 1640-serum, ditambahkan FBS 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI 1640 dan disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 μm. Media disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989).
5. Preparasi sampel
a. Pembuatan fraksi protein dariumbi teki
Umbi teki dikumpulkan segar, diseleksi lalu dicuci bersih dengan air mengalir. Umbi dipotong kecil-kecil lalu ditimbang sebanyak 400 gram,
dimasukkan ke dalam plastik dan disimpan dalam freezer selama dua malam. Bahan ditumbuk halus dengan penambahan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu 4°C. Bahan diperas dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 2010 xG selama 20 menit. Supernatan dikumpulkan dalam beaker glass 1000 ml dan diendapkan proteinnya dengan menambahkan amonium sulfat sebanyak 79,8 gram, stirrer semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 20 menit suhu 4°C. Supernatan (1) ditampung dalam beaker glass 1000 ml sedangkan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis dengan tabung dialisis dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit suhu 4°C. Pelet dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel FP20.
Supernatan (1) yang ditampung tadi kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak 74,2 gram, stirrer semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan (2) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit suhu 4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel FP40. Supernatan (2) yang ditampung tadi kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak 87,22 gram, stirer semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan (3) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM
pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit suhu 4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel FP60. Supernatan (3) yang ditampung tadi kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak 98,8 gram, stirer semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 xG selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 xG selama 20 menit pada suhu 4°C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel FP80
(Rosenberg, 1996).
b. Pengukuran estimasi kadar protein total
Fraksi protein umbi teki FP20, FP40, FP60, dan FP80 masing-masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan dapar natrium fosfat 5 mM, diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5 mM. Protein standar yang direkomendasikan adalah bovine serum albumin (BSA). Selanjutnya, kadar protein dapat dihitung dengan rumus : (Lampiran 4)
Kadar protein (mg/ml) = [1,55 E(280)] – [0,76 E(260)] mg/ml
Keterangan : E(280) = absorbansi larutan sampel yang terukur pada λ 280 nm
E(260) = absorbansi larutan sampel yang terukur pada λ 260 nm
6. Preparasi sel SiHa a. Propagasi sel SiHa
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifus 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI 1640 yang baru, disuspensikan perlahan-lahan. Suspensi sel disentrifus kembali 2010 xG selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut. b. Panen sel SiHa
Setelah jumlah sel cukup, medium diganti dengan medium RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml dan sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifus 2010 xG selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung jumlahnya menggunakan
haemocytometer. Pada suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga
memperoleh konsentrasi sel sebesar 3.104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989).
7. Preparasi sel Vero a. Propagasi sel Vero
Sel diambil dari nitogen cair, segera dicairkan dalam penangas air 37º C, kemudian ampul disemprot dengan etanol cair 70%. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung steril yang berisi medium M199. Suspensi sel disentrifus 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti M199 baru, disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifus lagi 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang. Sel ditambah 1ml medium pertumbuhan yang mengandung 10% FBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel ditumbuhkan dalam beberapa buah tabung biakan kecil 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan dengan konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut.
b. Panen sel Vero
Setelah jumlah sel cukup siap panen, sel dicuci dengan FBS 10% satu kali sebanyak 3 ml. Kemudian diberi tripsin 0,25% sebanyak 1 ml untuk melepaskan sel-sel. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifus selama 3 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga
memperoleh konsentrasi sel sebesar 3 x 104 / 100 μl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989). 8. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki
a. Sel SiHa
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 3x104/100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 4000 µg/ml pada sumuran B2, B3 dan BB4 pada baris 2, kemudian pada sumuran C2, C3 dan C4 di baris 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel SiHa pada sumuran yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 2000 µg/ml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi 100 µl medium RPMI 1640. Untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi 100 µl medium RPMI 1640. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam suhu 37 C, dalam inkubator dengan aliran 5% COo 2.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 2,5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100
μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar.
Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
b. Sel Vero
Untuk uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki pada sel Vero menggunakan langkah yang sama dengan uji sitotoksisitas pada sel SiHa. Perbedaannya hanya terletak pada media yang digunakan, yakni M199 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989).
9. Perhitungan persen kematian sel dengan metode MTT
Hasil dari metode MTT berupa absorbansi, didapat dari ELISA Reader mencerminkan jumlah sel yang hidup. Persen kematian sel dapat dihitung dengan rumus : % Kematian = x 100% A C) (B A− −
(Meyer et al., 1982 cit.,Candra, 2006) Keterangan :
A = Rata-rata absorbansi kontrol B = Rata-rata absorbansi perlakuan
C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel
Metode perhitungan statistik menggunakan analisis probit yang dilakukan untuk mengetahui harga LC50, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan uji
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tumbuhan
Tujuan dari determinasi tumbuhan adalah untuk memastikan kebenaran tumbuhan yang akan digunakan dalam penelitian. Determinasi tumbuhan perlu dilakukan untuk menghindari kesalahan dalam pengambilan sampel. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, menggunakan acuan baku Backer dan Backuizen van den Brink (1965). Hasil determinasi tumbuhan adalah sebagai berikut :
1b-2a-3b-4b-6b-7a-8a-11.Cyperus-1b-2b-15b-17b-19b-27b-37b-38b-39b-42b-43b-44a-45b-46a.Cyperus rotundus L.
Hasil determinasi yang dilakukan menunjukkan bahwa tumbuhan yang akan diteliti adalah benar tumbuhan Cyperus rotundus L. atau dikenal sebagai rumput teki.
Gambar 8. Foto tumbuhan Cyperus rotundus L.
Pada penelitian ini, tumbuhan yang digunakan adalah tumbuhan Cyperus
rotundus L. yang memiliki umbi sebesar kelingking bulat atau lonjong, berkerut
dan berlekuk. Sampel umbi teki yang digunakan bagian luar berwarna coklat dan bagian dalam berwarna putih (Gambar 17 dan 18). Pengambilan umbi teki dilakukan pada satu tempat dan waktu yang sama yaitu di daerah Bandelan, Sumberarum, Moyudan, Sleman (tepi Sungai Progo) pada bulan Juli 2006. Hal ini bertujuan untuk menghindari variasi kandungan kimia yang disebabkan perbedaan kondisi tempat dan waktu tumbuh tanaman. Umbi yang dikumpulkan dibersihkan dari tanah, kerikil, ataupun benda asing lain yang terbawa pada saat pengumpulan umbi teki untuk menghindari kontaminasi.
B. Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat perlu dilakukan sebelum penelitian dengan tujuan untuk menghilangkan kontaminan ataupun mikroorganisme pada alat-alat yang akan digunakan. Alat-alat dikumpulkan, dicuci bersih dengan sabun, dikeringkan, dan dibungkus dengan alumunium foil kemudian disterilisasi. Sterilisasi dilakukan menggunakan autoklaf pada suhu efektif 1210C dengan waktu standar 15 menit. Prinsip kerja autoklaf adalah menggunakan uap panas bertekanan dimana uap air panas yang akan membunuh mikroorganisme dengan mendenaturasikan protein (koagulasi protein) yang terdapat pada sel-sel mikroba. Keuntungan pada metode ini yaitu pemanasan berlangsung cepat, mempunyai daya tembus dan menghasilkan kelembaban yang tinggi (Pratama, 2006).
C. Preparasi Sampel Fraksi Protein Umbi Teki
Bahan umbi teki yang akan diteliti dicuci bersih untuk menghilangkan tanah dan bahan asing lain yang melekat. Umbi dirajang dan disimpan dalam
freezer sampai dilakukan preparasi sampel. Hal ini dimaksudkan untuk
mempermudah dalam penumbukan bahan. Semua perlakuan protein dilakukan secara steril pada suhu dingin (40C) untuk mencegah denaturasi dan reaksi enzim proteolisis yang dapat merusak protein. Fraksi protein ekstrak gubal diperoleh dengan penambahan sejumlah larutan dapar natrium fosfat 5 mM yang mengandung NaCl pada umbi teki yang telah ditumbuk halus. Larutan dapar berfungsi untuk memudahkan protein terekstraksi dari selnya yang terdapat pada umbi, dengan pH 7,2 ditujukan untuk menciptakan kondisi isotonis dengan cairan di dalam sel tumbuhan. Dengan adanya NaCl, protein akan berada dalam keadaan terlarut dan stabil di dalam dapar. Bahan diperas dan cairan yang diperoleh disentrifus selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh sebanyak 700ml merupakan ekstrak gubal dari umbi teki, kemudian dilakukan penambahan amonium sulfat sebanyak 74,6 g.
Protein yang ada dalam ekstrak gubal diendapkan secara bertingkat dengan penambahan garam amonium sulfat. Amonium sulfat adalah garam anion yang cukup efektif digunakan dalam pengendapan protein. Penambahan amonium sulfat harus dilakukan pada suhu 40C karena sifatnya yang sangat larut pada suhu rendah. Penambahan juga dilakukan sedikit demi sedikit sambil terus diaduk dengan bantuan pengaduk magnetik bertujuan untuk menghindari amonium sulfat terkonsentrasi pada satu tempat.
Tahap berikutnya, ekstrak gubal di-stirrer semalaman di dalam almari es dan dilanjutkan sentrifugasi pada 2010 xG selama 20 menit maka akan diperoleh supernatan dan endapan. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pada pH 7,2 dan selanjutnya didialisis sedangkan supernatannya ditampung untuk preparasi fraksi protein dengan derajat kejenuhan berikutnya.
Proses dialisis dilakukan untuk memurnikan protein dari amonium sulfat dan melepaskan molekul kecil lainnya yang dianggap kontaminan protein. Sampel dimasukkan pada membran dialisis dan direndam dalam larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 dalam beaker glass. Penggantian larutan dapar perlu