Seleksi Tanaman Transgenik Hasil Transformasi terhadap Cekaman Kekeringan

2006).

Evaluasi untuk cekaman kekeringan pada tanaman padi dapat dilakukan di lapangan dalam rumah kasa atau kaca, dan laboratorium, ketika tanaman berada pada fase vegetatif, generatif, maupun keduanya. Sammaullah dan Darajat (2001) melakukan evaluasi beberapa genotipe padi di lapangan maupun rumah kasa menggunakan pot plastik berisi 10 kg tanah. Oh et al. (2005) mengevaluasi padi transgenik yang mengandung gen Ubi:CBF3 dan Ubi:ABF3 dengan menggunakan pot berukuran 5cm x 5cm x 6 cm di rumah kaca. Ai et al. (2010) menggunakan media cair PEG di laboratorium pada fase perkecambahan padi ketika melakukan evaluasi indikator toleransi cekaman kekeringan

Materi tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah genotipe putatif transgenik yang mengandung gen OsDREB1A dengan promotor 35S. Gen ini merupakan gen regulator yang responsif terhadap suhu rendah dan over-ekspresinya dapat meningkatkan toleransi cekaman kekeringan dan atau suhu rendah (Kasuga et al. 2004).

Tujuan Penelitian

Untuk mengevaluasi toleransi padi transgenik cv. Nipponbare 35S::OsDREB1A terhadap cekaman kekeringan.

Metodologi Penelitian

A. Seleksi Tanaman Transgenik Hasil Transformasi terhadap Cekaman Kekeringan

Bahan Tanaman

Genotipe padi transgenik Nipponbare 35S::OsDREB1A generasi T1 yaitu B9, B11, B14, C3, C4, C9, C10, C12, dan C14. Genotipe-genotipe tersebut merupakan hasil seleksi pada media 100 mg/ l higromisin. Genotipe kontrol yaitu Kalimutu (toleran), Singkarak (peka) (Hermanto et al. 2009), dan Nipponbare. Pelaksanaan Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Rumah Kaca Fasilitas Uji Terbatas, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan

Juli sampai dengan September 2010. Rancangan percobaan sederhana setiap pot berisi lima tanaman padi.

Evaluasi terhadap Cekaman Kekeringan

Benih padi transgenik dari genotipe-genotipe yang terpilih, Nipponbare, Kalimutu dan Singkarak dikecambahkan pada petridis yang telah dilapisi kertas saring dan diberi air secukupnya. Benih padi transgenik dan Nipponbare yang telah pecah kulit dipindahkan ke media cair yang mengandung 100 mg/l higromisin selama 10 hari dengan tujuan mendapatkan bibit tanaman padi yang tahan terhadap higromisin. Bibit dipindahkan pada media air selama satu hari sebelum ditanam pada media tanah. sebanyak 5 tanaman ditanam untuk tiap pot. Pot (diameter 13 cm, tinggi 11 cm) diisi media tanam 700 g dengan komposisi : tanah + pasir + pupuk kompos dengan perbandingan= 1 : 1 : 1. Penyiraman dilakukan satu atau dua hari sekali sebanyak 750 ml / 10 kg tanah (Samaullah dan Daradjat 2001) sampai tanaman siap untuk uji kekeringan yaitu pada umur sekitar tiga - empat minggu. Perlakuan cekaman kekeringan diberikan dengan cara menghentikan penyiraman sampai tanaman peka (Singkarak) menunjukkan gejala layu dan dilakukan pengamatan pertama (daun menggulung pada fase vegetatif). Pengamatan selanjutkan dilakukan pada saat tanaman kontrol peka (Singkarak) mati atau semua daun mengering (daun mengering pada fase vegetatif) . Setelah selesai pengamatan kemudian dilakukan pemulihan tanaman dengan cara penyiraman. Tanaman yang masih tumbuh kemudian dilakukan penilaian kesembuhan. Penilaian skor penggulungan daun, pengeringan daun, dan kesembuhan tanaman dilakukan dengan berdasarkan skor pengamatan seperti yang dijelaskan pada Standard Evaluation System for Rice (IRRI 1996, Silitonga et al. 2003) seperti tertera pada Tabel 2–4 :

Tabel 2. Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung pada fase vegetatif)

Skor/skala Kriteria

0 Daun-daun sehat

3 Daun-daun melipat (sangat berbentuk huruf V) 5 Daun betul-betul kuncup (membentuk huruf U) 7 Ujung-ujung daun bersentuhan (bentuk O) 9 Daun menggulung ketat

Tabel 3. Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering pada fase vegetatif)

Skor/skala Keterangan 0 Tidak ada gejala

1 Ujung daun sedikit mengering

3 Ujung daun mengering sampai ¼ panjang pada hampir semua daun 5 ¼ sampai ½ dari semua daun betul-betul kering

7 Lebih dari ⅔ dari semua daun betul-betul kering 9 Tanaman mati

Tabel 4. Klasifikasi tanggap kesembuhan tanaman setelah perlakuan pemulihan

Skor/skala Keterangan 1 90-100% tanaman sembuh 3 70-89% tanaman sembuh 5 40-69% tanaman sembuh 7 20-39% tanaman sembuh 9 0-19% tanaman sembuh Isolasi DNA

Metode Dellaporta et al. (1983) yang sudah dimodifikasi digunakan untuk isolasi DNA. Daun padi yang masih muda dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam ependorf dua ml dan diberi gotri (pelor), kemudian dimasukkan ke dalam nitrogen cair dan divorteks sampai halus. Serbuk daun diberi larutan buffer ekstraksi DNA yang sudah ditambah Na-disulfit (0,38 g/100ml) sebanyak 700 µl. Selanjutnya tabung dipanaskan dalam water bath pada suhu 65°C selama lima menit. Untuk memisahkan asam nukleat dengan komponen lain ditambahkan kloroform : isoamyl alcohol (Chisam 24:1) dengan perbandingan 1 : 1, kemudian digoyang atau dikocok selama lebih kurang 50 kocokan, selanjutnya disentrifuge pada 12,000 rpm selama lima menit. Supernatan dipindahkan ke tabung ependorf 2 ml yang baru, kemudian ditambahkan ethanol absolut (98%) dengan perbandingan supernatant : etanol absolut = 1 : 2 dan dicampur dengan membalik-balikkan tabung. Selanjutnya tabung disentrifuse selama lima menit. Endapan DNA dicuci dengan etanol 70% dua kali, kemudian dikeringkan dalam pompa vakum. DNA dilarutkan dalam Tris-EDTA (TE) buffer sesuai dengan besar kecilnya endapan.

Amplifikasi PCR

Campuran reaksi (2 µl buffer 10 x PCR;1,2 µl MgCl; 0,4 µl DNTPs; 2 µl Primer HPTII; 0,16 µl Taq DNA; 9,24 µl ddH₂O; dan 5 µl sampel DNA)

dimasukkan ke dalam tabung PCR, kemudian diamplifikasi dengan mesin PCR pada program Hyg-60. Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi 94 ^oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus meliputi pemisahan (denaturation) pada suhu 94^oC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 55^oC selama 1 menit, pemanjangan primer (extension) pada suhu 72 ^oC selama 2 menit. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72 ^oC selama 5 menit. Hasil amplifikasi dicek dengan elektrofloresis gel agarose 0,8%. Delapan µl DNA + 1 µl blue juice dicampur kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Separasi dilakukan pada voltase 80 – 100 V selama sekitar satu jam. Gel direndam dalam larutan 0,5 g/ml Ethidium Bromide dan pita DNA divisualisasikan menggunakan Chemidoc.

Hhibridisasi Southern

Analisis hibridisasi southern yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan metode Trijatmiko et al. (2011) dengan prosedur pelaksanaan sebagai berikut.

Pemotongan DNA. DNA sampel transgenik generasi T1 dan kontrol non-transgenik dipotong menggunakan enzim EcoRI yang memotong sekali di dalam T-DNA. Total volume untuk masing-masing reaksi adalah 150 μl dalam ependrof steril 1.5 ml (10 ug DNA, menggunakan 3 μl enzim restriksi 10 U/ μl) dan reaksi diinkubasi semalam pada suhu 37^oC. Pada hari berikutnya, setiap sampel diambil 5 µl dan di elekrofloresis pada gel untuk memastikan bahwa DNA telah terpotong sempurna. Jika pemotongan telah baik akan terlihat smer yang homogen pada jalur. Jika DNA tidak terpotong sempurna, ditambahkan enzim lagi dan dilanjutkan pemotongan.

Pengendapan DNA. Pada reaksi digesti 150 µl ditambahkan 0,1x volume 3M Na acetat, pH 5,2 dan dicampurkan. Kemudian ditambah 2,5x volume 100% Ethanol dingin dan dicampur. Selanjutnya tabung disimpan pada suhu -20⁰C selama 2 jam. Tabung disentrifus selama 10 menit pada suhu 4^oC kemudian supernatan dibuang. Pelet ditambah 500 µl 70% ethanol dingin dan disentrifus selama 10 menit pada suhu 4^oC. Supernatan dibuang kemudian disentrifuse kembali selama 2 menit pada suhu 4^oC. Sisa supernatan dibuang dengan dipipet menggunakan pipet 20 µl, kemudian pelet dikeringkan pada vacum selama dua

menit. Pelet dilarutkan dalam 15 µl 0,1 x TE dan 3 µl 6x ficoll loading dye dan dinkubasi pada suhu 65^oC selama 15 menit. Tabung disentil-sentil setiap lima menit untuk melarutkan DNA.

Pemotongan Kontrol Positif. Pemotongan juga dilakukan pada 200 pg plasmid biner sebagai kontrol positif.

Elektroporesis gel agarose. Ditambahkan 343 ml ddH2O dalam botol 500 ml dan 2,45 agarose selanjutnya dipanaskan dalam microwave sampai larut. Ditambahkan 7 ml 50x TAE dalam botol dan dicampur dengan stirre. Setelah cukup dingin gel dituangkan ke dalam cetakan. Sampel (18 µl) dan MW markers (5 µl) diloading, selanjutkan di elektroforesis pada 30 volt semalam. Pada hari berikutnya voltase diturunkan menjadi 15 volt.

Prosesing gel. Gel dipotong untuk blotting dengan ukuran ( 20 cm x 10,5 cm ). Gel direndam pada larutan depurinasi dan digoyang selama 10 menit pada suhu ruang. Gel dicuci dengan air distilat ganda, selanjutknya gel direndam pada larutan denaturasi 2 x 15 menit pada suhu ruang dengan digoyang secara perlahan-lahan. Gel kemudian dicuci dengan air dobel distilat dan gel direndam pada larutan neutralisasi 2 x 15 menit pada suhu ruang. Selanjutnya gel direndam dalam 20 x SSC kurang lebih 10 menit.

Transfer gel. Membran dipotong dengan ukuran ( 20 cm x 10 cm ). Di bagian kanan atas diberi tanda dengan pensil: kultivar, kontruk, enzim restriksi, tanggal. Juga dipotong kertas whatman 3MM. Membran direndam selama 5 menit dalam 2x SSC. Bak diisi dengan 1L 20x SSC. Kaca diletakkan di atas bak dan kertas Whatman 3MM diletakkan diatas kaca dengan ujung-ujung kertas menyentuh larutan 20x SSC. Kertas Whatman 3MM dibasahi dengan 20x SSC, kemudian pipet digulungkan pada permukaan kertas untuk menghilangkan gelembung udara. Gel diletakkan di atas kertas Whatman 3MM kemudian pipet digulungkan pada permukaan gel untuk menghilangkan gelembung udara yang terdapat antara gel dan kertas. Membran diletakkan di atas gel dan pipet digulungkan di atas membran untuk menghilangkan gelembung-gelembung antara membran dan gel. Bagian gel yang tidak tertutupi membran dipotong. Kertas Whatman 3MM diletakkan di atas membran, dan gelembung udara antara membran dan kertas Whatman dibuang dengan menggunakan pipet. Seluruh

permukaan kertas Whatman di atas kaca yang tidak tertutupi gel, begitu juga bagian bak yang terbuka, ditutup dengan plastik pembungkus. Kemudian ditambahkan kertas tissue, dan gelas pemberat sekitar 200-500 g. Transfer blot dilakukan semalam di dalam transfer buffer (20x SSC). Pada hari berikutnya, blot dibongkar dan membran secara hati-hati diambil selanjutnya direndam selama 5 menit dalam larutan 2x SSC. Membran dikeringkan di atas kertas tissue selama 3 menit. Membran dibungkus dengan plastik pembungkus dan DNA difiksasi dengan sinar UV selama 5 menit pada 302nm dalam transilluminator. Membran bisa langsung digunakan untuk prehibridisasi atau disimpan di dalam tempat lembab diantara ( 2 kertas whatman 3MM dan dibungkus dengan plastik pembungkus ) pada suhu – 20^oC.

Labelling Menggunakan Polymerase Chain Reaction

Reagen yang diperlukan untuk setiap reaksi labelling (total volume 50 µl) adalah 29,25 µl dd H2O; 5 µl bufer PCR dengan MgCl2, 10 x konsentrasi; 5 µl PCR DIG mix, 10 konsentrasi; 2,5 µl primer 1 (5 µM); 2,5 µl primer 2 (5 µM); 0,75 µl enzim mix, expand high fidelity, 5 µl plasmid (20 pg/ µl). Disiapkan juga reaksi untuk amplifikasi (regular PCR menggunakan dNTPs) sebagai kontrol. Profil siklus suhu

1 siklus : 95^oC selama 2 menit. 30 siklus : 95^oC selama 30 detik, 60^oC selama 30 detik, 72^oC selama 40 detik. 1 siklus : 72^oC selama 7 menit.

Setiap reaksi dielektroforesis ( 5 µl ) pada gel agarose bersama dengan marker DNA. Jika labelling berhasil, akan terlihat probe yang sudah berlabel akan bermigrasi lebih lambat (bobot molekul lebih besar). dibandingkan probe kontrol (disebabkan adanya DIG). Intensitas DNA yang sudah berlabel akan sama atau agak berkurang dibandingkan DNA kontrol yang tidak berlabel ( disebabkan adanya DIG).

Hibridisasi

Membran dimasukkan ke dalam bak plastik yang mengandung 50 ml larutan DIG Easy Hyb dan dilakukan prehibridisasi sekitar 3 jam pada suhu 42^oC. Probe yang sudah berlabel sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang berisi air 50 µl. Tabung diinkubasi pada suhu 100^oC dalam blok pemanas selama 10 menit untuk denaturasi probe, selanjutnya dengan cepat didinginkan di

dalam es selama 5 menit. Satu menit sebelum inkubasi probe dalam es selesai, 50 mL larutan DIG Easy Hyb dipindahkan dari bak plastik ke tabung 50 mL. Kemudian probe yang sudah didenaturasi ditambahkan ke tabung yang berisi larutan DIG Easy Hyb tersebut dan dicampur dengan baik untuk membentuk larutan hibridisasi. Selanjutnya larutan hibridisasi dimasukkan ke bak plastik dan dilakukan hibridisasi semalam pada suhu 42^oC dengan penggoyangan.

Deteksi Menggunakan Chemiluminescent Reaction

Membran dicuci 2 x 5 menit dengan 200 ml washing 1 pada suhu kamar, selanjutnya 2 x 15 menit dengan 200 ml washing 2 pada suhu 68^oC. Untuk langkah selanjutnya dilakukan pada suhu ruang. Membran diseimbangkan selama 2 menit dengan 200 ml buffer 1 + Tween. Kemudian membran diinkubasi selama 30 menit sampai 3 jam dengan 200 ml buffer 2. Selanjutnya menggunakan bak plastik baru, membran dicuci untuk membuang antibodi yang berlebihan dengan diinkubasi 2 x 15 menit pada 200 ml buffer 1 + Tween. Selanjutnya membran diseimbangkan selama 3 menit dengan larutan 40 ml bufer 3. Membran diletakkan (bagian DNA menghadap ke atas) di atas plastik. Tiga ml Ready-to-use CDP-Star diteteskan pada permukaan blot sampai seluruh permukaan basah. Kemudian membran dibungkus dengan plastik pembungkus. Membran diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Cairan yang berlebih dalam plastik wrap dibuang. Selanjutnya membran dimasukkan dalam kaset dan film X-ray dimasukkan ke dalam kaset di ruang gelap. Film X-ray direndam selama 1 menit di dalam larutan developer dengan digoyang-goyang, 30 detik di dalam air, dan 2 menit dalam larutan fiksasi. Selanjutnya film X-ray dibilas dengan air ledeng dan dikering-anginkan.

B. Studi Fisiologi Gen OsDREB1A