HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil
G. Sindur Bogor AB693982 Kebun Raya ‐ Bogor AB693983
Lembang‐Bandung AB693984 Magelang AB693985 Hawaii EF125180 India 2 AJ698947 Malang AB693986 China Phal FJ356061 China Cym DQ067883 Taiwan AY571289 Singapura AF405719 India1 EU499362 Surabaya AB693987 PVX PVU19790
G. Sindur Bogor AB693982 Kebun Raya‐Bogor AB693983 Lembang‐Bandung AB693984 India1 EU499362 Magelang AB693985 Surabaya AB693987 Jepang AB197937 Korea Sel.AB541562 Hawaii EF125180 India2 AJ698947 Singapura AF405719 China Cym DQ067883 Taiwan AY571289 Malang AB693986 China Phal FJ356061 PerancisAM236028 PVX PVU19790
Persentase tingkat kesamaan nukleotida ORSV tertinggi (100%) yaitu antara isolat Cipanas-Cianjur dengan isolat Gunung Sindur-Bogor. Perbandingan nukleotida isolat TAIP-Jakarta, Cipanas-Cianjur dan Gunung Sindur-Bogor dengan 11 isolat asal negara lain terlihat bahwa tiga isolat tersebut memiliki similaritas 96,8%-99,1% dengan isolat Thailand. Demikian halnya tiga isolat tersebut juga memiliki similaritas tertinggi (97,4%-99,7%) dengan isolat Taiwan, Brazil, India, Hangzhou, Korea Selatan dan Florida. Hal berbeda terlihat antara isolat Kebun Raya-Bogor yang memiliki similaritas yang lebih rendah dengan isolat Singapura, Jerman, Yunani dan Jepang, serta memiliki similaritas yang tinggi dengan isolat Thailand. Tingginya tingkat homologi antar gen CP ORSV isolat Bogor, Cipanas dan TAIP-Jakarta (94,9-100%) menunjukkan bahwa ORSV isolat Pulau Jawa merupakan strain yang sama dengan isolat ORSV yang pernah dilaporkan sebelumnya.
Homologi berdasarkan sekuen asam amino antar isolat Pulau Jawa antara 92,4-100%, sedangkan antara isolat Pulau Jawa dengan 11 sekuen pada GeneBank diperoleh homologi berkisar 94,3–99,3%. Homologi antara isolat Cipanas-Cianjur dan Gunung Sindur-Bogor mencapai 100% yang menunjukkan asal isolat yang sama. Perbandingan asam amino antara isolat TAIP-Jakarta, Cipanas-Cianjur dan Gunung Sindur-Bogor dengan 11 isolat asal negara lain terlihat bahwa ketiga isolat tersebut memiliki similaritas 94,9%-98,7% dengan isolat Singapura, Jerman dan Jepang. Ketiga isolat tersebut memiliki similaritas yang tinggi dengan delapan isolat lainnya (95,5%-99,3%).
Perbandingan dengan Tobacco mosaic virus (TMV) dari Yunnan menunjukkan homologi nukleotida dan asam amino yang rendah yaitu masing- masing hanya 64,9%-66,5% dan 67,0%-70,8% (Tabel 3.14 dan 3.15). Hal ini menunjukkan bahwa ORSV berhubungan jauh dengan TMV walaupun masih dalam genus yang sama.
Tabel 3.14 Homologi nukleotida gen CP ORSV isolat Pulau Jawa dengan isolat-isolat dari beberapa negara lain
No Isolat Homologi (%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 TAIP_jakarta ‐ 97,6 94,9 97,6 97,4 97,2 97,4 97,2 97,4 97,2 97,4 96,8 97,4 97,4 97,0 64,9 2 Cipanas_cnjr ‐ 97,2 100 99,7 99,5 99,7 99,5 99,7 99,5 99,7 99,1 99,7 99,7 99,3 66,3 3 G.sindur_bgr 97,2 99,7 99,5 99,7 99,5 99,7 99,5 99,7 99,1 99,7 99,7 99,3 66,3 4 K.raya_bgr ‐ 97,0 96,8 97,0 96,8 97,0 96,8 97,0 97,6 97,0 97,0 96,866,1 5 Taiwan ‐ 99,7 100 99,7 100 99,7 100 99,3 100 100 99,5 66,5 6 Singapura ‐ 99,7 99,5 99,7 99,5 99,7 99,1 99,7 99,7 99,3 66,5 7 Brazil ‐ 99,7 100 99,7 100 99,3 100 100 99,5 66,5 8 Jerman ‐ 99,7 99,5 99,7 99,1 99,7 99,7 99,3 66,3 9 India ‐ 99,7 100 99,3 100 100 99,5 66,5 10 Yunnan ‐ 99,7 99,1 99,7 99,7 99,3 66,5 11 Hangzhou ‐ 99,3 100 100 99,5 66,5 12 Thailand ‐ 99,3 99,3 98,9 66,3 13 Korea Selatan ‐ 100 99,5 66,5 14 Florida ‐ 99,5 66,5 15 Jepang ‐ 66,3 16 TMVYunnan ‐ * Tingkat homologi nukleotida dihitung menggunakan program BioEdit versi 7.0.0, (Isis Pharmaceuticals, Inc). Angka dengan cetak tebal miring menunjukkan homologi antar sesama isolat Pulau Jawa Angka dengan cetak tebal warna merah menunjukkan homologi tertinggi pada baris yang sama Angka dengan cetak tebal warna biru menunjukkan homologi terendah pada baris yang sama
Tabel 3.15 Homologi asam amino gen CP-ORSV isolat Bogor dengan isolat-isolat dari beberapa negara lain
No Isolat Homologi (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 TAIP_jakarta ‐ 96,2 92,4 96,2 95,5 94,9 95,5 94,9 95,5 95,5 95,5 95,5 95,5 95,5 94,967,0 2 Cipanas_cnjr ‐ 95,5 100 99,3 98,7 99,3 98,7 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 98,770,1 3 G.sindur_bgr 95,5 99,3 98,7 99,3 98,7 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 98,770,1 4 K.raya_bgr ‐ 94,9 94,3 94,9 94,3 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 95,568,3 5 Taiwan ‐ 99,3 100 99,3 100 100 100 100 100 100 99,3 70,8 6 Singapura ‐ 99,3 98,7 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 98,7 70,8 7 Brazil ‐ 99,3 100 100 100 100 100 100 99,3 70,8 8 Jerman ‐ 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 98,7 70,1 9 India ‐ 100 100 100 100 100 99,3 70,8 10 Yunnan ‐ 100 100 100 100 99,3 70,8 11 Hangzhou ‐ 100 100 100 99,3 70,8 12 Thailand ‐ 100 100 99,3 70,8 13 KorSel ‐ 100 99,3 70,8 14 Florida ‐ 99,3 70,8 15 Jepang ‐ 70,8 16 TMVYunnan ‐ * Tingkat homologi nukleotida dihitung menggunakan program BioEdit versi 7.0.0, (Isis Pharmaceuticals, Inc). Angka dengan cetak tebal miring menunjukkan homologi antar sesama isolat Pulau Jawa Angka dengan cetak tebal warna merah menunjukkan homologi tertinggi pada baris yang sama Angka dengan cetak tebal warna biru menunjukkan homologi terendah pada baris yang sama
Alignment berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan adanya mutasi titik (point mutation) pada keempat isolat ORSV yang berbeda dengan 11 isolat dari negara lainnya. Mutasi terbanyak terjadi pada isolat ORSV Kebun Raya-
Bogor, sedangkan yang paling sedikit terjadi pada isolat Gunung Sindur-Bogor dan Cipanas-Cianjur (Tabel 3.16).
Mutasi titik yang terjadi pada keempat isolat ORSV menyebabkan perubahan asam amino pada beberapa titik. Mutasi nukleotida pada isolat TAIP- Jakarta dan Kebun Raya-Bogor tidak seluruhnya menyebabkan mutasi asam amino (Lampiran 2.1 dan 2.2). Pada isolat TAIP-Jakarta mutasi tidak bermakna di posisi nukleotida ke- 94 dan 475, Sedangkan isolat Kebun Raya-Bogor, mutasi tidak bermakna yaitu pada posisi nukleotida ke-38, 114, 198, 310, 336, 375, 377, 399 dan 420. Pada ORSV isolat Gunung Sindur Bogor dan isolat Cipanas- Cianjur ditemukan mutasi titik dari basa C ke T pada nukleotida ke-5 di N- terminal gen coat protein. Mutasi titik ini menyebabkan perubahan pada komposisi asam amino. Asam amino yang berubah yaitu asam amino ke-2 dari serine menjadi phenylalanine (Tabel 3.17, lampiran 2.2).
Tabel 3.16 Mutasi titik yang terjadi pada enam isolat ORSV asal Pulau Jawa yang dibandingkan dengan 10 isolat ORSV dari beberapa negara lain
Isolat Jumlah mutasi Urutan mutasi titik ke-
Gunung Sindur-Bogor 1 C5T*
Cipanas-Cianjur 1 C5T
TAIP-Jakarta 12 C5T, G33A, G34A, T40C, T41C, G44A,
G49A, G55A, C56A, G58C, C94T, T475A.
Kebun Raya-Bogor 13 C5T, C35G, A38T, A76C, A114C, C198T,
A310G, T336C, A375T, C377T, G379T, C399T, T420C
Keterangan : C = Cytosin, A = Adenin, T = Timin, G = Guanin
* C5T, dibaca mutasi pada basa ke-5 dari basa Cytosin menjadi Timin, dst
Tabel 3.17 Perbedaan asam amino pada gen CP empat isolat ORSV asal Pulau Jawa dengan 11 isolat ORSV dari beberapa negara lain.
Huruf dengan cetak tebal menunjukkan perbedaan dengan asam amino lainnya dalam kolom yang sama. Phe= phenylalanine, Ser = Serine, ala = alanine,Pro = Proline, gly= glycine, thr = threonine, leu= leusine, asn = Asparagine, his= histidine, arg = arginine.
Isolat Posisi asam amino pada gen CP
2 12 14 15 17 19 20 26 125 126 127
Gunung Sindur Bogor phe ala leu ser ala ala asp ala arg ser ala
Kebun Raya-Bogor phe gly leu ser ala ala asp his ser phe ser
Cipanas-Cianjur phe ala leu ser ala ala asp ala arg ser ala
TAIP-Jakarta phe thr pro asn thr asn his ala arg ser ala
Konsensus 11 Isolat luar negeri
Analisis Filogenetika ORSV
Hasil analisis kekerabatan yang digambarkan dalam pohon filogenetika berdasarkan sekuen nukleotida dan asam amino. TMV digunakan sebagai pembanding di luar grup (Gambar 3.11). Berdasarkan analisis filogenetika, ORSV isolat-isolat Pulau Jawa sangat dekat kekerabatannya dan berada dalam satu kelompok berdasarkan homologi nukleotida dan asam amino. Secara keseluruhan antar semua isolat membentuk tiga kelompok (cluster) dalam pohon filogenetika. Jika dibandingkan antara pohon filogenetika nukleotida dan asam amino hanya sedikit perbedaan yaitu pada isolat Kebun Raya-Bogor. Hal ini kemungkinan karena adanya mutasi nukleotida pada isolat Kebun Raya-Bogor, namun mutasi tersebut tidak bermakna karena filogenetika asam amino menempatkan isolat Kebun Raya-Bogor pada kelompok yang sama (kelompok pertama). Kelompok kedua berdasarkan asam amino yaitu ORSV isolat Brazil, China (Yunan), Taiwan, India, Korea Selatan, Jerman, Thailand, Florida dan China (Hangzou). Kelompok ketiga yaitu ORSV isolat Jepang dan Singapura lebih jauh dari isolat Indonesia. Walaupun membentuk tiga cluster, namun kekerabatan antar isolat masih sangat dekat. Hal ini terlihat pada pohon filogenetika tersebut hanya membentuk sub grup (Gambar 3.13 a dan b).
Berdasarkan bukti ini menunjukkan bahwa ORSV menyebar dari satu negara ke negara lain secara langsung melalui bahan perbanyakan tanaman terinfeksi yang terjadi melalui aktivitas ekspor/impor. Perbedaan asal benua (Asia, Eropa dan Amerika) tidak memperlihatkan perbedaan nukleotida dan asam amino yang berarti hal ini menunjukkan virus ini relatif stabil dalam berbagai kondisi lingkungan.
Gambar 3.13 Pohon filogenetika ORSV berdasarkan nukleotida (a) dan asam amino (b)
gen coat protein ORSV isolat Pulau Jawa. Analisis menggunakan software
MEGA versi 4.0 (Tamura et al. 2007). TMV digunakan sebagai
pembanding out group
Respon Tanaman Indikator terhadap Infeksi ORSV
Uji penularan ke tanaman indikator menunjukkan bahwa ORSV dapat menginfeksi hampir semua tanaman indikator yang diuji (Tabel 3.18). Gejala yang ditimbulkan pada sebagian besar tanaman indikator berupa lesio lokal, sedangkan pada tanaman Cassia occidentalis awalnya berupa lesio lokal namun selanjutnya gejala berubah menjadi mosaik sistemik pada daun-daun yang tidak diinokulasi. Pada tanaman indikator N. tabacum v. xanthi gejala yang ditunjukkan ORSV khas berbentuk cincin dengan lingkaran yang besar (Gambar 3.12).
BRAZIL AF515606