METODE PENELITIAN 4.1 Bahan Penelitian
4.6 Skrining Fitokimia Ekstrak
Skrining fitokimia bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung pada rimpang lengkuas. Rimpang lengkuas segar dikeringkan kemudian dilakukan pengecilan ukuran partikel sampai diperoleh serbuk simplisia yang halus. Kemudian diekstraksi dengan cara maserasi.
4.6.1 Pemeriksaan Alkaloid 1. Reaksi Pengendapan
Ekstrak yang setara dengan 20 gram bahan dipanaskan diatas penangas air sampai seperti sirup. Setelah dingin ditambahkan 10 ml HCl 2N kemudian dipanaskan di atas penangas air selama 3-5
menit. Setelah dingin ditambahkan 0,5 gram NaCl untuk mengendapkan protein yang dapat memberikan reaksi positif palsu, lalu disaring, kemudian filtrat ditambahkan HCl 2N sampai 10 ml. Filtrat yang digunakan untuk petunjuk alkaloid dengan penambahan pereaksi pengendapan. Pereaksi yang digunakan antara lain Wagner, Meyer, dan Bouchardat. Ekstrak mengandung alkaloid timbul endapan setelah ditambah dengna perekasi tersebut.
2. Kromatografi Lapis Tipis
Filtrat ditambahkan NH4OH 28% sampai alkalis, diekstraksi dengan 10 ml CHCl3, fase CHCl3 ditambahkan NaSO4 eksikatus, disaring, kemudian diuapkan sampai kering. Ekstrak CHCl3 dilarutkan dalam metanol dengan uji KLT.
Fase gerak : aseton : air : amoniak (40 : 7 : 3 ) Penampak noda : pereaksi dragendorf
Positif jika terjadi noda merah jingga (Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990 ; Harborne, 1973).
4.6.2 Pemeriksaan Glikosida Saponin 1. Uji Buih
Sekitar 5 ml ekstrak dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian dikocok kuat dengan air suling 20 ml. Buih yang timbul diukur. Positif jika terjadi buih stinggi 3 cm diatas cairran, stabil selama 30 menit. Sebagai pembanding digunakan daging buah Sapindus rarak (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990 ; Thokcromet al, 2014).
2. Reaksi warna
Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan, diuapkan diatas penangas air sampai kering. Setelah dingin, dikocok dengan 10 ml n-heksan atau petroleum eter. Kemudian didekantir dan filtrat
dibuang. Diulang sampai n-heksan atau petroleum eter tidak berwarna. Residu ditambah 10 ml CHCl3, kemudian di gojok selama 5 menit, didekantir dalam tabung reaksi yang berisi 100 mg NaSO4 anhidrat, saring. Filtrat dibagi 3 (A,B,C) (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990).
a. Tes Liebermann-Burchard
A sebagai blanko, B ditambah 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat, kemudian dikocok pelan. Positif ika terjadi perubahan warna hijau-biru untuk saponin steroid, merah violet untuk saponin triterpenoid dan kuning muda untuk saponin tak jenuh (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990).
b. Tes Salkowski
A sebagai blanko, C ditambah 1-2 ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung reaksi. Positif mengandung sterol tak jenuh bila terdapat cincin merah pada fase asam (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990).
3. Kromatografi Lapis Tipis
a. Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan ditambah dengan pelarut yang sesuai, ditotolkan pada fase diam sampai terlihat noda pada lampu UV, kemudian di eluasi dengan fase gerak. Langkah ini untuk identifiksai adany steroid atau triterpenoid bebas.
b. Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan ditambah 2 ml HCl 1N, direfluks diatas penangas air selama 2-6 jam untuk menghidrolisi saponin. Setelah dingin dinetralkan dengan amonia, kemudian diuapkan diatas penangas air sampai kental lalu ditambah 3 ml n-heksan, kemudian diekstraksi sebanyak 3 kali. Setelah itu fase n-heksan dikumpulkan, lalu diuapkan ditambah 5 tetes CHCl3
Fase diam : silika gel GF 254
Fase gerak : n-heksan : etil asetat (3:2) Penampak noda : Anisaldehid-asam sulfat
Positif bila terjadi noda warna merah ungu setelah lempeng KLT dipanaskan diatashot plate(Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990).
4.6.3 Pemeriksaan Flavonoid 1. Reaksi warna
Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan, dipanaskan diatas penangas air sampai kering. Diekstraksi berulang-ulang dengan petroleum eter atau n-heksan sampai cairan tidak berwarna. Residu ditambahkan 20 ml etanol 80% disaring, filtrat dibagi empat (A,B,C,D)
a. Tes Bate smith & Metcalf
A sebagai blanko, B ditambah 0,5 ml HCl pekat, kemudian dipanaskan selama 15 menit diatas penangas air.
Positif jika terjadi warna merah terang atau ungu (leukoantosianin) (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990) b. Tes Wilstater
A sebagai blanko, C ditambahkan 0,5 ml HCl pekat dan 4 potong magnesium. Diamati warna yang terjadi, diencerkan dengan air suling, kemudian ditambah 1 ml butanol. Diamati waran yang terjadi pada setiap lapisan.
Perubahan warna merah jingga menunjukkan adanya flavon, merah pucat adanya flavonol, merah tua menunjukan flavanon.
2. Kromatografi Lapis Tipis
Fase diam : silika gel GF 254 tebal 0,25 mm
Fase gerak : butanol : asam asetat glasial : aquadest (4:1:5) Penampak noda : sitrat borat atau CeSO4 atau uap amonia atau FeCl3
2%
Noda yang diamati dengan pereaksi sitrat borat dan dengan sinar UV kemudian dibandingkan dengan noda dari rutin. Adanya flavonoid ditunjukan dengan adanya noda kuning terang, coklat lemah, kuning hijau, merah jingga.
Bila disemprot dengan CeSO4 akan timbul warna orange sampai coklat atau bila dialari uap amoia akan timbul warna kuning tidak permanen dan apabila dengan pereaksi FeCl3 2% akan timbul warna gelap (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990).
4.6.4 Pemeriksaan Tannin 1. Preparasi Sampel
a. ekstrak dengan berat 0,3 gram ditambah 6 ml akuades panas, diaduk dan dibiarkan sampai temperatur kamar, lalu tambahkan 3-4 tetes 10% NaCl, diaduk, dan disaring.
b. Filtrat dibagi menjadi tiga bagian masing-masing ± 4 ml dan disebut sebagai larutan IVA, IVB, dan IVC
2. Uji Gelatin
a. Larutan IVA digunakan sebagai blanko, larutan IVB ditambah dengan sedikit larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%.
b. Jika terjadi endapan putih menunjukkan adanya tannin. 3. Uji Ferriklorida
Sebagai Larutan IVC diberi beberapa tetes larutan FeCl3, kemudian diamati terjadinya perubahan warna.
a. Jika terjadi warna hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin.
b. Jika pada penambahan gelatin dan NaCl tidak timbul endapan tetapi setelah ditambahkan dengan larutan FeCl3
terjadi perubahan warna menjadi hijau biru hingga hitam, menunjukkan adanya senyawa polifenol.
FeCl3(+) , Uji Gelatin (+) → tannin (+) FeCl3(+) , Uji Gelatin (-) → polifenol (+) FeCl3(-) , Uji Gelatin (-) → tannin (-) 4.6.5 Pemeriksaan Glikosida Jantung
1. Tes Keller-Killiani
Ekstrak yang setara dengan 10 gram bahan, diuapkan diatas penangas air sampai kering. Diekstraksi berulang-ulang dengan n-heksan sampai n-heksan tidak berwarna.
Residu diuapkan untuk menghilangkan n-heksan, ditambah 3 ml FeCl3, diaduk-aduk, dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan H2SO4pekat melalui dinding tabung reaksi. Adanya cincin ungu menunjukan adanya gula 2 deoxy. 2. Tes Liebermann-Burchard seperti pada saponin
Positif untuk inti steroid jika terbentuk warna hijau-biru. (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990) 4.6.6 Pemeriksaan Glikosida Antrakuinon
1. Reaksi warna a. Tes Borntrager
Ekstrak yang setara dengan 1 gram bahan, diuapkan sampai kering. Setelah dingin, ditambahkan 10 ml air suling, kemudian disaring, filtrat diekstraksi dengan toluen 5 ml dalam corong pisah 2 kali. Fase toluena diambil kemudian dibagi dua
(A,B). A sebagai blanko, B ditambah 5 ml amonia, kemudian dikocok.
Positif jika terjadi warna merah pada lapisan alkali (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990)
b. Modifikasi Borntrager Test
Ekstrak yang setara dengan 1 gram bahan, diuapkan diatas penangas air sampai kering. Setelah dingin ditambah 10 ml KOH 5N dan 1 ml H2O2 encer, dipanaskan diatas penangas air selama 10 menit kemudian disaring. Filtrat ditambah asam asetat glasial sampai reaksi asam. Diekstraksi dengan toluen 2 kali masing-masing 5 ml. Fase tolena diambil, di bagi dua (A,B). A sebagai blanko, B ditambah 2-5 ml larutan amonia.
Positif jika terjadi warna merah pada lapisan alkali (Zaini & Indrayanto, 1978 ; Fong, Tin-Wa, & Fransworth, 1990)
3. Kromatografi Lapis Tipis
Bahan : 0,1-0,2 ml ekstrak etanol
Fase diam : silika gel GF 254 tebal 0,25 mm yang telah diimpregnasi dengan NaOH 0,01 M
Fase gerak : kloroform : etil asetat : asam asetat (75:24:1) Penampak noda : larutan KOH 10% metanol
Positif jika noda kuning, kuning0cokelat, merah, violet, hijau (Harborne, 1973)
