METODE PENELITIAN
3.7 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa alkaloid, glikosida, glikosida antrakuinon, saponin, flavonoid, tanin serta triterpenoid/steroid (Depkes, 1995; Harborne, 1987; Farnsworth, 1966).
3.7.1 Identifikasi Triterpenoid/Steroid
Sebanyak 1 gram serbuk simplisia, direndam dengan 20 mLn-heksana selama 2 jam lalu disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard (LB), munculnya warna merah ungu atau hijau biru menunjukkan adanya triterpenoid/steroid (Harborne, 1987).
3.7.2 Identifikasi Alkaloid
Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, ditambahkan 1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut:
a. diambil 0,5 mL filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan berwarna putih/kuning.
b. diambil 0,L ml filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
c. diambil 0,5 mL filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga
26 percobaan di atas (Depkes, 1995).
3.7.3 Identifikasi Tanin
Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 10 mL air suling selama 15 menit lalu disaring. Filtrat diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1-2 tetes larutan pereaksi besi (III) klorida 10%. Larutan akan terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.7.4 Identifikasi Flavonoid
Sebanyak 10 gram serbuk simplisia ditambahkan 10 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan 0,1 gram serbuk magnesium, 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).
3.7.5 Identifikasi Saponin
Sebanyak 0,5 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL air panas dan disaring. Larutan atau filtratnya diambil masukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, jika terbentuk buih yang stabil pada tabung reaksi selama tidak kurang dari 10 menit dengan tinggi buih 1-10 cm serta dengan penambahan beberapa tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin (Depkes, 1995).
3.7.6 Identifikasi Glikosida
Sebanyak 3 gram serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 30 mL campuran dari 7 bagian etanol 95% dan 3 bagian air suling, ditambahkan asam
27
klorida 2 N hingga pH larutan 2, direfluks selama 10 menit, dinginkan dan disaring. Diambil 20 mL filtrat, kemudian ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal (II) asetat 0,4 M dikocok dan didiamkam selama 5 menit, lalu disaring.
Filtrat diekstraksi dengan 20 mL campuran 3 bagian kloroform dan 2 bagian isopropanol, ini dilakukan sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperature tidak lebih dari 50oC, sisanya dilarutkan dalam 2 mL metanol.
Larutan ini digunakan untuk percobaan berikut: larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air, sisanya ditambah 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molisch kemudian ditambah 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Cincin ungu akan terbentuk menunjukkan adanya gula (Depkes, 1995).
3.8 Pengukuran Kadar Flavonoid Total dan Fenol Total dari Ekstrak Etilasetat Daun Afrika
3.8.1 Penentuan Kandungan Flavonoid Total (Metode Kolorimetri) 3.8.1.1 Pembuatan Larutan Kuersetin sebagai Standar
Sebanyak 1 mg kuersetin ditimbang, dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL (konsentrasi larutan 100 ppm). Dipipet 2,5 mL dari setiap konsentrasi 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm, 6,25 ppm, kemudian dilarutkan dengan metanol hingga 5 mL. Dari masing-masing konsentrasi dipipet 2 mL larutan, kemudian ditambahkan 0,1 mL aluminium klorida (AlCl3) 10%, 0,1 natrium asetat (CH3COONa), serta ditambahkan 2,8 mL akuades, lalu diinkubasi selama 40 menit. Diukur absorbansi laarutan standar kuersetin pada masing-masing konsentrasi serta panjang gelombang maksimum pada konsentrasi larutan 100 ppm terhadap reagen yang digunakan sebagai blanko secara spektrifitimetri
UV-28
Vis (400-800). Dihasilkan kalibrasi pada 432 nm menggunakan konsentrasi terhadap kuersetin.
3.8.1.2 Uji Flavonoid Total dari Ekstrak Etil Asetat Daun Afrika (EEADA) Kandungan flavonoid total merujuk pada prosedur Chang et al., (2002) dengan beberapa konsentrasi menggunakan kuersetin sebagai standar. Ekstrak etil asetat daun afrika ditimbang sebanyak 25 mg dilarutkan dengan metanol hingga 25 mL (konsentrasi larutan 1000 ppm). Dipipet 3 mL larutan ditambahkan metanol hingga 10 mL (konsentrasi larutan 300 ppm). Diambil 2 mL larutan kemudian ditambahkan 0,1 mL aluminium klorida (AlCl3) 10%, 0,1 mL natriun asetat (CH3COONa) serta 2,8 mL akuades. Diinkubasi selama 40 menit. Diukur absorbansi larutan ekstrak etil asetat daun afrika terhadap standar kalibrasi kuersetin. Standar kalibrasi plot kuersetin dihasilkan pada panjang gelombang 432 nm. Konsentrasi flavonoid dalam sampel uji yang dihitung dari plot kalibrasi dan dinyatakan sebagai kuersetin setara mg/g sampel.
3.8.2 Penentuan Kandungan Fenol Total (Metode Folin-Ciocalteu) 3.8.2.1 Pembuatan Larutan Asam Galat sebagai Standar
Ditimbang 5 mg asam galat kemudian dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL (konsentrasi larutan 500 ppm). Dipipet 2,5 mL dari setiap konsentrasi 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 62,5 ppm, 31,25 ppm kemudian dilarutkan dengan metanol hingga 5 mL. Masing –masing konsentrasi dipipet 0,1 mLlarutan, kemudian ditambahkan 7,9 mL akuades, 0,5 mL Folin-Ciocalteu, divortex selama kurang lebih 1 menit, serta ditambahkan 1,5 mL natrium carbonat (Na2CO3) 20%, lalu diinkubasi selama 90 menit. Terjadi perubahan warna pada tabung yaitu warna biru karena fenol mengalami reaksi redoks kompleks dengan asam
29
phosphomolibdat pada reagen Folin-Ciocalteu di medium alkali yang mengakibatkan berwarna biru kompleks, molibdenum biru. Diukur absorbansi larutan standar asam galat pada masing-masing konsentrasi serta panjag gelombang maksimum pada konsentrasi larutan 500 ppm terhadap reagen yang digunakan sebagai blanko secara spektrofotometri UV-Vis (400-800 nm).
Dihasilkan kalibrasi pada 775 nm menggunakan konsentrasi terhadap asam galat.
3.8.2.2 Uji Fenol Total dari Ekstrak Etil Asetat Daun Afrika (EEADA)
Total kandungan fenol yang ada dalam ekstrak etilasetat dianalisis menggunakan reagent Folin-Ciocalteu seperti yang dijelaskan oleh (Slinkard and Singleton, 1977) yang sudah dimodifikasi. Ditimbang ekstrak etilasetat daun Afrika sebanyak 10 mg, larutkan dengan metanol hingga 10 mL (konsentrasi 1000 ppm). Larutan uji diambil 0,1 mL, kemudian ditambahkan 7,9 mL akuades, 0,5 mL Folin-Ciocalteu, divortex selama kurang lebih 1 menit, lalu ditambahkan 1,5 mL natrium karbonat (Na2CO3) 20%, lalu diinkubasi selama 90 menit. Terjadi perubahan warna pada tabung yaitu warna biru karena fenol mengalami reaksi redoks kompleks dengan asam phosphomolibdat pada reagen Folin-Ciocalteau di medium alkali yang mengakibatkan berwarna biru kompleks, molibdenum biru.
Diukur absorbansi larutan uji terhadap kalibrasi asam galat pada 775 nm.
Konsentrasi fenol dalam larutan uji dihitung dari plot kalibrasi dan dinyatakan sebagai mg asam galat setara dengan mg/g dari sampel.
30 BAB IV