BAB II STUDI PUSTAKA
A. Tinjauan Pustaka
6. Spektrodensitometri in situ
Pada era perkembangan teknik kromatografi saat ini pemakaian “Thin Layer Chromato Scanner” yang lebih popular dengan nama densitometri makin banyak dipakai oleh para peneliti secara luas.
Densitometri merupakan metode penetapan kadar suatu senyawa pada lempeng kromatografi, menggunakan instrumen TLC Scanner, pengukuran dilakukan dengan cara mengukur serapan analit (cahaya yang diukur dapat berupa cahaya yang dipantulkan/ yang diteruskan), pemadaman fluoresensi untuk lapisan yang mengandung bahan berfluoresensi analit atau hasil reaksi analit (Touchstone
& Roger, 1980).
Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT.
Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada KLT yang ditentukan adalah absorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluoresensi atau pemadaman pendar fluoresensi dari radiasi semula. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit dengan kadar yang sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT (Mulja, 1995).
Densitometri adalah alat pelacak kuantitatif yang sangat terkenal. Alat ini dilengkapi dengan spektrofotometer yang panjang gelombangnya dapat diatur dari 200-700 nm. Alat tersebut dinamakan TLC Scanner. Teknik penggunaannya
didasarkan pada pengukuran sinar yang diteruskan, diserap, dan dipantulkan atau yang dipendarkan. Sinar yang dipantulkan mengalami hambatan oleh pendukung lempeng dan keseragaman fase diamnya. Sinar yang dipantulkan dengan arah yang sudah pasti menuju bercak, sehingga dapat dipantau jumlah sinar yang diserap. Sinar ini sangat sensitive, maka untuk setiap senyawa dapat dicari panjang gelombang maksimalnya. Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer, tetapi pada densitometri digunakan alat khusus yaitu reflection photomultifier, sebagai pengganti photomultifier pada spektrofotometer yang dapat memperbesar tenaga beda potensial listrik sehingga mampu menggerakkan integrator (Sumarno, 2002).
a. Peralatan
Semua densitometri pemayar mempunyai rancang bangun tertentu, yang meliputi sumber cahaya, perangkat pemilih panjang gelombang, sistem pengumpul, dan pemusat cahaya seperti detektor. Selain itu diperlukan mekanisme gerak lempeng di bawah cahaya terpusat untuk “memayar” lempeng.
Skema sederhana dan jenis peralatan diperlihatkan oleh gambar 3(a) dan (b).
Dalam bagian ini pemilih panjang gelombang adalah monokromator (MK) dan perangkat indera adalah photomultiplier (PM). Bila tabung photomultiplier diletakkan di bawah lempeng, alat bekerja sebagai penerus (T), bila diletakkan di atas lempeng, alat bekerja sebagai pengukur pantulan (R). Konfigurasi bagi alat sinar tunggal diperlihatkan Gambar 3(a). Gambar 3(b) menunjukkan alat sinar ganda yang menggunakan pemecah sinar (PS) untuk memusatkan sinar berpanjang gelombang sama ke permukaan lempeng. Satu sinar memayar bagian lempeng yang mengandung analit, yang lain memayar bagian lempeng blanko untuk mengoreksi penimbrung bawaan lempeng. Konfigurasi ini perlu sepasang tabung photomultiplier berimbang untuk mendapatkan kemantapan maksimal sistem. Alih-alih penyaring, penggunaan monokromator lebih menguntungkan karena memudahkan pengubahan panjang gelombang dan menghasilkan berkas sinar dengan sedikit panjang gelombang. Bila digunakan monokromator pemayar, pemayaran tuntas untuk mendapat informasi spektroskopi analit dapat dilaksanakan di tempat. Waktu payar lebih santai dibandingkan HPLC karena dapat dihentikan sewaktu-waktu pada panjang gelombang yang dikehendaki.
Untuk teknik sidik pemantulan, tabung photomultiplier ditempatkan pada sudut 45 derajat terhadap lempeng. Jenis sumber cahaya tergantung pada panjang gelombang cahaya yang digunakan, yaitu: lampu hidrogen, raksa atau xenon untuk pengukuran sinar UV dan lampu wolfram untuk panjang gelombang sinar tampak (Munson, 1991).
Target penempatan photomultiplier, bagan di Gambar 3 dapat digunakan untuk pengukuran serapan cara penerusan atau pantulan. Meskipun konfigurasi sinar ganda mengurangi timbrungan bawaan lempeng, sedikit ketidakseragaman pada permukaan lempeng dan komponen tidak diinginkan dapat menimbulkan masalah. Untuk mengatasinya lebih lanjut dapat digunakan alat berkas ganda / sistem transmisi dan pantulan secara bersamaan atau sistem dua panjang gelombang (Munson, 1991).
Gambar 3. Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b).
S = sumber, MK = monokromator, PM = photomultiplier dan PS = pemecah sinar, arah sinar
b. Cara kerja densitometer
Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan, diuji dulu kedudukan masing bercak pada sumbu (X,Y), agar sinar dapat tepat mengenai pusat bercak.
Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempatkan pada satu, garis deretan Y untuk bercak diatur, dan gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan bercak, menggunakan mikrokomputer. Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan
S
secara maksimal, bila belum diketahui dilakukan scanning terlebih dahulu.
Kemudian dilakukan scanning untuk pengujian kuantitatif yang metodenya ada 2 macam.
1) Cara memanjang, sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga bercak hanya dideteksi sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y (Y1 sampai Y2).
Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat simetris.
2) Sistem zig-zag, sistem ini tidak diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi berbelok-belok sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan X1-X2.
Maka harus diperhatikan dalam pelacakan tersebut adalah sebagai berikut.
a) Besarnya bercak, sehingga X1 sampai X2 lebih besar dari garis tengah bercak agar semua bercak teruji.
b) Delta Y, selisih garis kesatu dan kedua makin kecil makin rata pengukurannya, antara 0,001 sampai 0,1 mm kode yang diperlukan angka 1 sampai dengan 3.
Penggunaan metode zig-zag lebih merata pengukurannya, lebih-lebih bila delta Y menggunakan jarak terkecil. Kelemahannya hanya pada waktu, tetapi ketelitian pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan metode pengamatan lurus. Dalam pengamatan lurus bila bercaknya tidak simetris akan kurang teliti sebab konsentrasi terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak bercak. Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah dilakukan secara otomatis oleh alat, karena satuan (mikro volt) yang tertera merupakan besaran puncak. Kadang-kadang prosentasi yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari puncak yang muncul (tergambar).
Gambar 4. Pelacakan bercak secara zig-zag dengan bentuk puncaknya (a), dan pelacakan secara lurus (b).
(Fried et al., 1996) Prinsip analisis kuantitatif dengan metode densitometri hampir sama dengan metode spektrofotometri. Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda pada plat KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT dan KGC, sebab area noda kromatogram diukur pada posisi diam atau “zig-zag” menyeluruh. Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati parabola (Mulja, 1995).
c. Fitur dari TLC Scanner
Fitur-fitur dari TLC Scanner antara lain :
1) Pengukuran pemantulan, baik dalam bentuk fluorescence atau absorbansi, pengukuran transmisi opsional.
2) Format objek sampai dengan 200 x 200mm.
3) Range spektrum dari 190 sampai 800 nm.
4) Lampu sumber radiasi: deuterium, halogen-tungsten, dan lampu merkuri tekanan tinggi.
5) Resolusi yang dihasilkan 25-200 µm.
6) Kecepatan scanning/pembacaan 1-100 mm/s.
7) Spektrum merekam sampai dengan 100nm/s.
8) Pengoperasian alat dilakukan secara otomatis.
9) Perpindahan data / data yang dihasilkan cepat (Anonim, 2007f).
Arah sumbu pelacakan
Sumbu Y arah placakan
x Sumbu Y arah pelacakan
Puncak
d. winCATS – Planar Chromatography Manager 1) Mengendalikan semua fungsi scanner.
2) Kalkulasi hasil, menyediakan data statistik.
3) Menyimpan secara lengkap parameter yang digunakan bersamaan dengan semua data yang diperoleh dari pembacaan data mentah yang didokumentasikan dalam suatu file, dan mencetak hasil yang diinginkan.
4) Mematuhi ketentuan-ketentuan GMP/GLP dan 21CFR11 (Anonim, 2007f).