BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.8 Spektrofotometer UV–Visibel
Spektrofotometri adalah pengukuran absorpsi energi cahaya oleh suatu atom atau molekul pada panjang gelombang tertentu. Daerah spektrum ultraviolet biasanya dianggap berkisar dari 200 hingga 400 nm dan daerah sinar tampak dari 400 hingga 750 nm (Duiharianto, 2020).
Menurut Duiharianto (2020), ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometer ultraviolet dan sinar tampak yaitu :
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Cara yang digunakan adalah dengan merubahnya menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu sehingga dapat menyerap sinar UV-Vis.
b. Waktu kerja (operating time)
Tujuannya ialah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dan absorbansi larutan.
c. Pemilihan panjang gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal.
d. Pembuatan kurva kalibrasi
Dilakukan dengan membuat seri larutan baku dalam berbagai konsentrasi kemudian absorbansi tiap konsentrasi diukur lalu dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi.
e. Pembacaan absorbansi sampel
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8.
Alat spektrofotometer pada dasarnya terdiri dari sumber sinar, monokromator, tempat sel untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan alat ukur atau pencatat (Depkes, RI, 2016). Diagram sederhana spektrofotometer UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1 Diagram sederhana spektrofotometer UV-Vis (Duiharianto, 2020).
BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Tahapan penelitian meliputi isolasi protein kerang darah (Anadara granosa L.), hidrolisis protein dengan variasi waku 1 jam, 3 jam, dan 5 jam, setelah itu dilakukan pengujian kadar protein lalu dilanjutkan dengan uji aktivitas antioksidan terhadap isolat dan hidrolisat protein Kerang Darah dengan metode aktivitas pemerangkapan radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl) yang diukur secara spektrofotometri visibel. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian, Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat dan Bahan Penelitian 3.1.1 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi aluminium foil (Kiln Pak), Blender (Miyako), cawan petri, erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), Inkubator (Memmert), kain saring batis, kertas perkamen, labu tentukur (Pyrex), pipet ukur (Iwaki Pyrex), neraca analitik (Boeco Germany), pH meter (Eutech Instrument), pipet tetes, pH meter (Hanna), sentrifugator (Hitachi CF16RXII), spatula, sonikator (Branson 1510), stopwatch, spektrofotometer UV-Visible (Shimadzu UV-1800), vial dan waterbath shaker (Stuart).
3.1.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: akuades, buffer A (Tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%), buffer B (Tris-HCl 2 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M), DPPH
(1,1 diphenyl-2-picrylhydrazil) (PT. Smartlab Indonesia), Enzim Tripsin, , Kerang Darah, Bovine Serum Albumin (BSA), lowry A (Folin Ciocalteu dengan akuades 1:1), lowry B (Na2CO3 2%, NaOH 0,1 N, CuSO4.5H2O 1%, Natrium Kalium Tatrat 2%), Metanol p.a (Merck kode bahan 1.06009.2500), Vitamin C p.a (Chem-Supply Pty Ltd kode bahan AA022).
3.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Sampel Kerang Darah (Anadara granosa L.) diperoleh dari Pasar Belawan, Kota Medan, Sumatera Utara. Sampel kerang yang telah terkumpul dibersihkan menggunakan air mengalir. Kerang kemudian dipisahkan antara cangkang dan bagian daging kerang. Secara umum, bagian dari kerang yang digunakan untuk penelitian ini adalah keseluruhan daging yang berada di dalam cangkang kerang yaitu sebanyak 500 gram.
3.3 Pembuatan Pereaksi 3.3.1 Buffer A
Buffer A (Tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M; β-mercaptoetanol 1%, Triton X-100 0,5%) dibuat dengan cara menambahkan Tris (Hidroksimetil) aminometana sebanyak 6,05 gram, NaCl sebanyak 58,5 gram, dan 0,555 gram CaCl2 dilarutkan dengan akuades. Ditambahkan dengan HCl sampai pH 8,3. Ditambahkan β-mercaptoetanol sebanyak 15 mL triton X-100 sebanyak 2,5 mL. Dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 500 ml, kemudian dihomogenkan.
3.3.2 Buffer B
Buffer B (Tris-HCl 0,1 M pH 8,3; NaCl 2 M; CaCl2 0,01 M) dibuat dengan cara menambahkan Tris (Hidroksimetil) aminometana sebanyak 6,05 gram, NaCl sebanyak 58,5 gram, dan 0,555 gram CaCl2 dilarutkan dengan akuades. Ditambahkan dengan HCl sampai pH 8,3. Dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 500 ml, kemudian dihomogenkan.
3.3.3 Lowry A
Folin Ciocalteu sebanyak 2 ml ditambahkan akuades, kemudian dihomogenkan.
3.3.4 Lowry B
Na2CO3 2% dilarutkan dalam 100 ml NaOH 0,1 N. Ditambahkan 1 mL Na-K-Tatrat 2% dan 1 mL CuSO4.5H2O 1% kemudian dihomogenkan.
3.4 Isolasi Protein Kerang Darah
Daging kerang darah ditimbang sebanyak 500 gram berat segar, lalu dihaluskan dengan 800 ml pelarut Buffer A menggunakan blender, kemudian disaring dengan kain saring batis. Selanjutnya filtrat yang diperoleh dibeku-cairkan sebanyak 3 kali lalu disentrifugasi pada 6000 rpm pada suhu 4o C selama 30 menit, selanjutnya supernatannya (mengandung protein kasar kerang darah) disimpan dalam lemari pendingin sebelum dilanjutkan proses hidrolisis dan pengujian antioksidan (Niche, dkk., 2017).
3.5 Hidrolisis Protein Kerang Darah
Sebanyak 45 mL isolat protein dimasukkan ke dalam erlenmeyer.
Ditambahkan 7,5 mL enzim trispin 1%, (perbandingan enzim – substrat yaitu 1:
6). Diatur pH 8 dengan penambahan HCl 0,5 N. Dimasukkan ke dalam waterbath shaker pada suhu 37˚C, selama 1 jam, 3 jam, dan 5 jam. Dihentikan hidrolisis dengan pemanasan pada suhu 90˚C selama 15 menit (Ismanto, 2016). Hidrolisat protein kerang darah siap dianalisis.
3.6 Penentuan Kadar Protein Terlarut
Kadar protein ditentukan berdasarkan metode Lowry, dkk (1951), menggunakan BSA sebagai standar. Dilakukan pengenceran larutan sampel dengan cara diambil 0,5 ml lalu dimasukkan ke dalam labu 100 mL, kemudian dicukukan dengan akuades. Diambil 2 mL larutan sampel yang telah diencerkan, dimasukkan ke dalam vial lalu ditambahkan 2,75 mL pereaksi Lowry B. Larutan campuran dihomogenkan lalu diinkubasi selama 10-15 menit pada suhu kamar.
Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL pereaksi Lowry A, dihomogenkan dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Absorbansinya kemudian diukur pada panjang gelombang 740,6 nm. Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara mensubtitusikan absorbansi larutan ke dalam persamaaan regresi kurva kalibrasi larutan standar protein (Sari, dkk., 2013).
3.7 Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
Kemampuan sampel uji dalam meredam proses oksidasi radikal bebas DPPH (1,1 diphenyl-2-picrylhidrazyl) dalam larutan metanol (sehingga terjadi perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning) dengan nilai IC50 (konsentrasi sampel uji yang mampu meredam radikal bebas 50%) digunakan sebagai parameter menentukan aktivitas antioksidan sampel uji (Molyneux, 2004).
3.7.1 Pembuatan Larutan Induk Baku DPPH (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil) dengan Konsentrasi 200 μg/ml.
Ditimbang DPPH sebanyak 10 mg dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml, dilarutkan dengan metanol dan dicukupkan hingga garis tanda lalu dihomogenkan sehingga diperoleh larutan DPPH konsentrasi 200 μg/ml (Molyneux, 2004).
3.7.2 Pembuatan Larutan Blanko
Diambil 5 ml larutan DPPH dengan konsentrasi 200 μg/ml lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan metanol hingga garis tanda (konsentrasi 40 μg/ml) (Molyneux, 2004).
3.7.3 Pengukuran Serapan Maksimum DPPH
Larutan DPPH dengan konsentrasi 40 μg/ml dimasukkan ke dalam kuvet lalu ditempatkan pada spektrofotometer. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 400-800 nm.
3.7.4 Pembuatan Larutan Pembanding Vitamin C Konsentrasi 200 μg/ml Ditimbang 10 mg serbuk vitamin C dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml, dilarutkan dengan metanol dan dicukupkan hingga garis tanda (konsentrasi 200 μg/ml)
3.7.5 Penentuan Waktu kerja (Operating Time)
Diukur absorbansi larutan DPPH konsentrasi 40 μg/ml pada panjang gelombang 516 nm setiap 1 menit selama 60 menit dan diamati waktu larutan tersebut mulai menghasilkan absorbansi yang stabil, yang akan digunakan sebagai waktu kerja (operating time) pada prosedur selajutnya.
3.7.6 Uji Aktivitas Peredaman Radikal Bebas DPPH Vitamin C
Dipipet 1 ml larutan baku DPPH konsentrasi 200 μg/ml kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 5 ml lalu ditambahkan larutan vitamin C
×100%
konsentrasi 1 μg/ml, 2 μg/ml, 3 μg/ml, 4 μg/ml dan 5 μg/ml masing-masing sebanyak 0,025 ml, 0,05 ml, 0,075 ml dan 0,1 ml, dan 0,125 ml, lalu dicukupkan dengan metanol hingga garis tanda. Kemudian diinkubasi selama 35 menit pada suhu kamar. Diukur absorbansi tiap larutan pada panjang gelombang 516 nm dengan spektrofotometer UV-Visible.
3.7.7 Uji Aktivitas Peredaman Radikal Bebas DPPH dari Sampel Uji Dipipet 1 ml larutan baku DPPH konsentrasi 200 μg/ml kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml lalu ditambahkan larutan sampel konsentrasi 26,25 μg/ml, 52,50 μg/ml, 78,75 μg/ml, 105 μg/ml dan 131,25 μg/ml masing-masing sebanyak 0,05 ml, 0,1 ml, 0,15 ml, dan 0,2 ml dan 0,25 ml dari sampel isolat dan hidrolisat protein, ditambahkan metanol hingga garis tanda, dihomogenkan, kemudian diinkubasi selama 35 menit pada suhu kamar.
Selanjutnya diukur absorbansi masing-masing sampel pada panjang gelombang 516 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Visible.
3.7.8 Pengujian Meode DPPH dengan Spektrofotometri
Larutan uji yang telah dipersiapkan, segera diinkubasi pada suhu 37o C selama 35 menit. Selanjutnya kontrol dan sampel uji diukur pada panjang gelombang 516 nm. Besarnya aktivitas antioksidan dihitung dengan mengunakan rumus:
% peredaman = Akontrol-Asampel Akontrol Keterangan :
Akontrol = Absorbansi tidak megandung sampel Asampel = Absrbansi sampel
Selanjutnya hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dengan kosentrasi sampel (μg/mL). Sebagai absis (sumbu X) dan nilai % peredaman (antioksidan) sebagai kooridinatnya (sumbu Y).
3.7.9 Penentuan Nilai IC50
Perhitungan yang digunakan dalam penentuan aktivitas pemerangkapan radikal bebas adalah nilai IC50 (Inhibitory Concentration), nilai tersebut menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat memerangkap radikal bebas sebesar 50% (Molyneux, 2004).
Nilai IC50 diperoleh dengan menggunakan persamaan regrasi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi sampel dengan simbol X terhadap aktivitas penangkapan radikal dengan simbol Y. Semakin kecil nlai IC50 maka senyawa tersebut mempunyai keefektifan sebagai penangkap radikal lebih baik (Erviana, dkk, 2016). Penentuan IC50 dari persamaan regresi y = ax + b
Keterangan : y = Nilai IC50
x = Sampel a = Slope/gradient b = intersept
Secara spesifik, suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 50 μg/mL, kuat untuk IC50 bernilai 50-100 μg/mL, sedang jika IC50 bernilai 101-150 μg/mL dan lemah jika IC50 bernilai lebih dari 150 μg/mL (Fidrianny, dkk., 2014). Bagan kerja penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Isolasi dan Hidrolisis Protein dari Kerang Darah (Anadara granosa L.) Isolasi protein dilakukan terhadap 500 gram kerang darah (Anadara granosa). Gambar kerang darah dapat dilihat pada Lampiran 2. Isolasi dilakukan dengan melisis sel. Proses lisis sel dilakukan dengan cara homogenisasi dengan menggunakan blender dan dilarutkan dengan buffer A. Hal ini bertujuan untuk memecahkan sel – sel dari kerang sehingga protein yang terdapat pada sel dapat larut dalam buffer A. Adanya kandungan Triton-X 100 dan β-mercaptoetanol dalam buffer A berfungsi untuk membantu proses lisis sel secara kimia dengan menegangkan plasma sehingga dengan adanya gesekan fisik sel akan terpecah.
Proses beku-cair dilakukan untuk menyempurnakan proses lisis sel (Niche, dkk., 2017). Pemisahan endapan dan supernatan dilakukan melalui proses sentrifugasi.
Adapun prinsip dari sentrifugasi yaitu memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan berada di atas (Niche, dkk., 2017). Dari hasil isolasi, diperoleh isolat protein dengan total volume sebesar 575 ml, isolat dapat dilihat pada Gambar 4.1
Setelah proses isolasi selesai, dilanjutkan dengan proses hidrolisis isolat kerang darah dengan enzim tripsin 1% pada pH 8, suhu 37˚C, dengan rasio enzim – substrat (1: 6) dengan variasi waktu hidrolisis (1, 3, dan 5 jam) dengan menggunakan waterbath shaker. Proses hidrolisis dihentikan melalui pemanasan yaitu dipanaskan pada suhu 900C selama 15 menit untuk menginaktivasi enzim agar tidak terjadi proses hidrolisis berlebih. Pada suhu 900C menyebabkan produk hidrolisat mengalami denaturasi. Pada saat protein mengalami denaturasi maka tidak ada ikatan kovalen pada rangka peptida yang rusak sehingga deret asam amino tetap utuh setelah denaturasi . Hasil hidrolisis isolat protein dapat dilihat pada lampiran 2.
Hidrolisat protein adalah hasil proses penguraian protein menjadi peptida-peptida sederhana maupun asam amino melalui proses hidrolisis. Semakin lama waktu hidrolisis, struktur molekul protein semakin pendek. Hidrolisis enzimatis dapat memotong protein menjadi asam amino dan peptida dengan ukuran yang bervariasi dengan bantuan molekul air (Nursafitri, 2019).
4.2. Pengukuran Kadar Protein Terlarut
4.2.1 Hasil Pengukuran Absorbsi Maksimum dan Kurva Kalibrasi Larutan Standar BSA
Panjang gelombang maksimum ditentukan agar mengetahui waktu absorpsi mencapai maksimum sehingga waktu tersebut dapat digunakan untuk meningkatkan proses absorbsi larutan Folin-Ciocalteau dan dapat menghasilkan warna kebiruan yang dapat dibaca di antara (500-750 nm). Pada penelitian ini diperoleh pada panjang gelombang 740,6 nm dan absorbansinya sebesar 0,474.
Pada penelitian ini digunakan BSA yang berfungsi untuk membuat kurva standar.
Hasil pengukuran absorpsi maksimum dapat dilihat pada Gambar 4.2
Gambar 4.2 Kurva Absorpsi Maksimum Bovine Serum Albumin (BSA) Kurva standar BSA perlu ditentukan karena menjadi dasar penentuan konsentrasi kadar protein di dalam larutan, yang menghubungkan antara konsentrasi dan absorbannya. Setelah itu, pada nilai panjang gelombang 740,6 nm dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi BSA dan digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang konsentrasinya belum diketahui. Data hasil pengukuran Kurva Kalibrasi Larutan BSA dapat dilihat pada Lampiran 3.
Sedangkan kurva kalibrasi BSA dapat dilihat pada gambar 4.3
Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Bovine Serum Albumin (BSA)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1
I
Konsentrasi (mg/ml)
Absorbansi
Y = 7,8902X + 0,0020 R2= 0,9989
4.2.2 Pengukuran Kadar Protein Terlarut
Hasil pengukuran kadar protein terlarut isolat dan hidrolisat protein dapat dapat dilihat pada Tabel 4.1 dan perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 4.
Tabel 4.1 Hasil Pengukuran Konsentrasi Protein Terlarut N
Kadar protein terlarut menunjukkan jumlah protein larut air yang terdapat dalam bahan pangan dan mudah dicerna karena berbentuk oligopeptida.
Penentuan kadar protein terlarut dilakukan dengan menggunakan metode Lowry menggunakan BSA sebagai larutan standar (Lowry (1951).
Isolat dan hidrolisat protein kerang darah menghasilkan warna biru ketika dilakukan uji dengan perekasi Folin-Ciocalteau. Reagen Folin- Ciocalteau bereaksi dengan protein yang terdapat pada sampel membentuk senyawa kompleks yang berwarna. Pembentukan kompleks berwarna tersebut disebabkan karena adanya reaksi antara basa Cu2+ dengan sampel protein yang diuji (Nursafitri, 2019).
Semakin lama waktu hidrolisis maka protein terlarutnya semakin meningkat dikarenakan terjadi pemotongan ikatan peptida pada bagian dalam atau bagian tengah sehingga menghasilkan ikatan peptida dengan rantai pendek yang semakin banyak (Nielsen, 1997).
4.3. Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Isolat dan Hidrolisat Protein Kerang Darah
4.3.1 Hasil Penentuan Absorpsi Maksimum
Pengukuran serapan maksimum larutan DPPH 40 μg/mL dalam metanol dengan menggunakan spektrofotometer UV-Visible memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 516 nm. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa hasil tersebut termasuk dalam kisaran panjang gelombang sinar tampak yaitu 400-800 nm serta termasuk dalam rentang panjang gelombang DPPH yang berkisar antara 515-520 nm (Molyneux, 2004). Prosedur dan hasil pengukuran absropsi maksimum menggunakan Spektrofotometer UV-Visible dapat dilihat pada Gambar 4.4
Gambar 4.4 Kurva Absorpsi Maksimum DPPH 4.3.2 Penentuan Waktu Kerja (Operating Time)
Waktu kerja bertujuan untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil yang ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan. Hasil analisis pengukuran waktu kerja dengan menggunakan larutan DPPH dalam metanol dengan konsentrasi 40 μg/ml diukur selama 60 menit, menunjukkan kestabilan pada menit ke-35 sampai dengan menit ke-38.
Lama pengukuran metode DPPH yang direkomendasikan berdasarkan literatur yaitu 30 menit (Molyneux, 2004). Hasil penentuan waktu kerja (operating time) dapat dilihat pada Lampiran 5.
4.3.3 Aktivitas Peredaman (%) DPPH dari Sampel Uji
Hasil Pengujian aktivitas persen peredaman DPPH sampel dapat dilihat pada Gambar 4.5.
Gambar 4.5 Kurva Persen Peredaman DPPH oleh Isolat dan Hidroliat Protein Kerang Darah
Keterangan :
H1 : Hidrolisat 1 jam H3 : Hidrolisat 3 jam H5 : Hidrolisat 5 jam
Pada hasil analisis aktivitas antioksidan dapat dilihat adanya penurunan nilai absorbansi DPPH yang diberi larutan uji terhadap kontrol pada setiap kenaikan konsentrasi. Aktivitas antioksidan isolat dan hidrolisat protein lebih rendah jika dibandingkan dengan Vitamin C dimana hasil pengujiannya data dilihat pada Gambar 4.6. Sedangkan perhitungan persen peredaman DPPH dapat dilihat pada Lampiran 6.
Gambar 4.6 Kurva Persen Peredaman DPPH oleh Vitamin C
Berdasarkan Gambar 4.5 dan Gambar 4.6 menunjukkan kenaikan persentase peredaman dengan adanya peningkatan konsentrasi dari senyawa antioksidan. Hal ini dikarenakan isolat dan hidrolisat, protein kerang darah memiliki komponen peptida bioaktif dan asam amino dalam jumlah yang besar yang diketahui bermanfaat sebagai antioksidan. Berkurangnya radikal bebas ditandai dengan adanya perubahan warna larutan dari ungu menjadi kuning pucat hal ini berkorelasi dengan nilai persentase inhibisi dimana semakin besar nilai perentase inhibisi maka akan memiliki aktivitas antioksidan yang semakin kuat (Suryohudoyo, 1993). Hal ini akan menyebabkan terjadinya penurunan absorbansi yang membuktikan adanya aktivitas pemerangkapan radikal bebas DPPH oleh sampel uji dan vitamin C.
4.3.4 Hasil Pengukuran Aktivitas Antioksidan protein Kerang Darah
Hasil pengukuran aktivitas antioksidan isolat dan hidrolisat protein kerang darah dinyatakan dengan nilai IC50, dapat dilihat pada Tabel 4.2. Sedangkan Perhitungan nilai aktivitas antioksidan dapat dilihat pada Lampiran 7.
0
Tabel 4.2 Aktivitas antioksidan (IC50) sampel dan vitamin C
Larutan uji Nilai IC50
Vitamin C
Isolat Protein
H1
H3
H5
Pengukuran aktivitas antioksidan pada penelitian ini menggunakan metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl) yang merupakan senyawa radikal nitrogen. Hasil dapat diamati dengan terjadinya perubahan warna dari ungu menjadi kuning. Perubahan warna menunjukkan bahwa DPPH telah tereduksi oleh proses donasi hidrogen atau elektron dari senyawa antioksidan sehingga warnanya berubah dari ungu menjadi kuning (Yamaguchi, dkk., 1998). Aktivitas antioksidan isolat dan hidrolisat protein bisa dipengaruhi oleh beberapa asam amino yang memiliki gugus fenolik sehingga dapat mendonorkan ion hidrogen untuk menstabilkan radikal bebas. Hal itu bisa dipengaruhi karena adanya asam amino tirosin, serin, threonine, lisin, glisin, triptofan, valin, histidin, isoleusin, prolin, dan fenilalanin yang dapat yang dapat mereduksi radikal bebas dengan mendonorkan ion hidrogen (Samaranayaka dan Li-Chan, 2011). Nilai IC50
digunakan untuk mengukur efektivitas sampel uji dalam menangkap senyawa radikal bebas (DPPH) sebesar 50%. Nilai IC50 ditentukan dengan cara menghitung konsentrasi sampel uji yang diperlukan untuk menangkap senyawa radikal DPPH.
Berdasarkan Tabel 4.2, Nilai IC50 pada isolat protein sebesar 126,20 µg/ml, yang termasuk dalam kategori sedang, sedangkan penelitian yang telah dilakukan Niche, dkk., 2017 nilai IC50 dari isolat protein kerang darah sebesar 21,11 µg/ml yang termasuk dalam kategori sangat kuat. Perbedaan ini bisa
disebabkan karena faktor lingkungan perairan tempat pengambilan sampel yang berpengaruh pada kualitas organisme yang hidup di dalamnya (Astrini, dkk., 2014). Nilai aktivitas antioksidan mengalami perubahan seiring berjalannya waktu hidrolisis Hasil pengukuran aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan terendah yaitu pada isolat protein sebesar 126,20 µg/ml, sedangkan yang tertinggi yaitu sebesar 102,25 µg/ml, yang diperoleh dari perlakuan waktu hidrolisis selama 5 jam. Aktivitas antioksidan meningkat seiring bertambahnya waktu hidrolisis.
Nilai tersebut sejalan dengan konsentrasi protein terlarut yang diperoleh, dimana pada perlakuan dengan waktu hidrolisis selama 5 jam mempunyai konsentrasi protein terlarut yang paling tinggi dibandingkan dengan waktu hidrolisis yang lainnya yaitu sebesar 39,48 mg/ml. Kristiansson dan Rasco (2000) menyatakan bahwa hidrolisis secara enzimatis dapat memperkecil ukuran molekul peptida dengan memecah ikatan peptida. Selama hidrolisis interaksi antara enzim dengan substrat yang semakin lama menyebabkan peningkatan pemutusan ikatan peptida menjadi lebih sederhana sehingga kelarutan protein juga akan semakin meningkat. Nursafitri, (2011) menyatakan bahwa hidrolisis enzim mampu meningkatkan konsentrasi protein terlarut yang berbanding lurus dengan peningkatan aktivitas antioksidan.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan :
a. Hasil pengujian kadar protein terlarut menunjukkan bahwa kerang darah mengandung protein bioaktif dengan konsentrasi protein terlarut pada isolat sebesar 32,445 mg/ml, hidrolisat 1 jam sebesar 34,65 mg/ml, hidrolisat 3 jam sebesar 36,435 mg/ml, dan pada hidrolisat 5 jam sebesar 39,48 mg/ml.
b. Hasil Pengujian Aktivitas Antioksidan menunjukkan bahwa protein kerang darah memiliki aktivitas antioksidan kategori sedang dengan masing-masing nilai IC50 pada isolat protein sebesar 126,20 µg/ml, hidrolisat 1 jam sebesar 120,32 µg/ml, hidrolisat 3 jam sebesar 116,74 µg/ml, dan pada hidrolisat 5 jam sebesar 102,25 µg/ml.
5.2 Saran
Disarankan pada peneliti selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antioksidan hasil hidrolisis dengan menggunakan enzim yang lainnya seperti papain, pepsin dan alkalase dengan konsentrasi penambahan enzim dan waktu yang berbeda serta membandingkan aktivitas antioksidannya
DAFTAR PUSTAKA
Ahmadi, M.B. 2018. Hidrolisat Protein Kacang Tunggak (Vigna unguiculata L.Walp.) Bersifat Menghambat Aktivitas Angiotensin-1 Converting Enzyme (ACE-1). Skripsi. Jember: Fakultas Teknlogi Pertanian.
Universitas Jember. Halaman 10.
Akbar, 2017. Isolasi dan Pemurnian Enzim α-Glukosidase dari Beras Ketan Putih (Oryza sativa Var. Glutinosa) Serta Amobilisasi dengan Matriks Karagenan Secara Mikroenkapsulasi. Skripsi. Fakultas MIPA.
Universitas Hasanuddin. Makasar. Halaman 10.
Almatsier, S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Umum. Halaman 12, 218.
Arif, M., Rahman, N., Supriadi. 2018. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Kluwih (Artocarpus Communis). Jurnal Akademika Kimia. 7(2): 85-86.
Astrini, A.D.R., Yusuf, M., Santoso, A. 2014. Kondisi Perairan terhadap Struktur Komunitas Makrozoobenthos di Muara Sungai Karanganyar dan Tapak, Kecamatan Tugu, Semarang. Journal of Mariane Research. 3(1):27-36.
Aziz, Z., Wikanta, T., Subagio, T. 2007. Analisis Glikoprotein dalam Daging Mytilus viridis, Anadara granosa, dan Anadara maculosa. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 5(1) :1-5.
Depkes RI. (2016). Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta: Ditjen POM, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 772.
Diaman, 2016. Analisis profil Protein Kerang Darah (Anadara granosa) yang dipajan ion logam Timbal (Pb) dengan Variasi Konsentrasi. Skripsi.
Program Studi Div Analisis dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. Semarang. Diphenyl-2-picrylhydrazyl. Biosci. Biotechnol.
Biochem. 62(6): 1201-1204.
Diana, M.F. 2010. Fungsi dan Metabolisme Protein dalam Tubuh Manusia. Jurnal Kesehatan Masyarakat. 4(1): 47-51.
Duiharianto, S. 2020. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etil Asetat dan Etanol Daun Cermai (Phyllanths acidus L.) dengan Metode Pemerangkapan DPPH.
Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas Sumatera Utara. Medan. Halaman 21.
Fidrianny, I., Darmawati, A., Sukrasno. 2014. Antioxidant Capacities from Different Polarities Extracs of Cucurbitaceae leaves Using FRAP, DPPH Assay and Correlation with Phenolic, Flavonoid, Carotenoid Content.
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 6(2):
858-862.
Hanani, E., Mui’im, A., Sekarini, R., Wiryowidagdo, S. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callispongia sp. dari Kepulauan Seribu. Jurnal Ilmi Kefarmasian. 2(3): 127-133.
Ismanto, A. 2016. Hidrolisis protein Tanduk Rusa Sambar (Rusa unicolor) Serta Potensinya Sebagai Penurun Resiko Hipertensi. J. Trop. Pharm. Chem.
3(3):185-189.
Julianto. 2003. Teknik Penanganan Ikan. Penebar Swadaya. Jakarta. Halaman 9.
Kalsum, U., Hafizah, I., Aritrina, P., Sulastrianah. 2020. Uji Aktivitas Antioksidan Hidrolisat Protein Kerang Pasir (Semele cordifornis) dengan
Khaira, K. 2010. Menangkal Radikal Bebas Antioksidan. Jurnal Saintek.
2(2):183-187.
Kristiansson, H.G., Rasco, G.A. 2000. Fish Protein Hydrolysates: Production, Biochemical, and Functional Properties. Critical Reviews in Food Science Nutrition. 40(1): 40-43.
Kurniawan, Lestari, S., Hanggita, S. 2012. Hidrolisis Protein Tinta Cumi (Loligo sp) dengan Enzim Papain. Fishtech. 1(1): 42.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. 1951 Protein Measurement Witj Folin Phenol Reagent. The Journal of Biological Chemistry. Halaman 265-274.
Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical diphenylpicryl-hydrazil (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin Journal Science Technology. 26(2): 211-219.
Nagir, M.T. 2013. Morfometri Kerang Darah Anadara granosa L. pada Beberapa Pasar Rakyat Makassar Sulawesi Utara. Skripsi. Universitas Hasanuddin.
Fakultas MIPA. Halaman 4-5.
Niche, D., Ahmad, A., Ferial, E.W. 2017. Isolasi, Pemurnian dan Identifikasi Protein Bioaktif dari Kerang Darah (Anadara granosa L.) Sebagai Antioksidan. Makassar: Universitas Hassanudin. Halaman 1.
Niche, D. 2017. Isolasi, Pemurnian dan Identifikasi Protein Bioaktif dari Kerang
Niche, D. 2017. Isolasi, Pemurnian dan Identifikasi Protein Bioaktif dari Kerang