BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.5 Elusidasi Struktur dengan Metode Spektroskopi
2.5.4 Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
Prinsip kerja dari spektroskopi NMR didasarkan pada penyerapan gelombang oleh inti tertentu dalam suatu molekul organik seperti proton dan atom karbon-13 dalam medan magnet (Watson, 2005). Spektroskopi NMR memberikan gambaran tentang jumlah dan lingkungan proton dalam senyawa (1H-NMR) dan menentukan jumlah atom karbon dalam senyawa (13C-NMR) (Atun, 2014). Pengukuran spekrum NMR dilakukan dengan menggunakan sejumlah kecil sampel yang dilarutkan ke dalam sejenis pelarut inert yang tidak memiliki inti 1H, contohnya adalah CCl4, CDCl3, CD3OD, atau TMS (tetrametilsilan). Senyawa yang digunakan sebagai standar baik untuk spektra 1H ataupun 13C adalah TMS [(CH3)4Si] yang menghasilkan puncak tunggal di daerah dengan pergeseran kimia 0 ppm (Watson, 2005).
31 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam rentang bulan Januari 2018 sampai Juni 2018 di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian Kimia, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) PUSPIPTEK Serpong, Tangerang Selatan. Analisis
1H dan 13C NMR dilakukan di Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan (BBRP2BKP), Slipi Petamburan, Jakarta Pusat.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, botol 100 mL, botol vial, tabung reaksi, rak tabung reaksi, mikropipet, vortex, mortar dan alu, timbangan analitik, timbangan teknis, hot plate, chamber, pisau cutter, pipa kapiler, pinset, pipet volume, botol semprot dan kromatografi kolom gravitasi.
Peralatan lain yang digunakan adalah rotary evaporator Butchi R-124, melting point Fisher Scientific, lampu ultraviolet (UV lamp) CAMAG 𝜆 254 dan 366 nm, microplate reader Thermo Scientific Varioskan Flash, mikroskop Olympus CKX 41, inkubator CO2 Thermo Scientific Series 8000 WK, sumuran 96-well plate, spektrofotometer UV-Vis Cary 60 Agilent Technologies, spektroskopi FTIR Shimadzu, spektroskopi NMR JEOL-ECS 400 MHz untuk 1H-NMR dan 100 MHz untuk 13C-NMR, UPLC Acquity-MS/MS Xevo G2-XS Quadrupole TOF.
32 3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel kulit batang G. maingayi dari Kepulauan Riau, Indonesia yang telah diekstraksi menggunakan n-heksana. Pelarut organik yang digunakan adalah pelarut kualitas teknis terdestilasi (n-heksana, etil asetat atau EA, metanol atau MeOH). Bahan lain yang digunakan yaitu silika gel 60 (Merck, 35-70 mesh dan 70-230 mesh), Kromatografi Lapis Tipis (KLT) plat aluminium berlapis silika gel 60 F254 (Merck, 0,25 mm), larutan DPPH 0,04%
(Sigma Aldrich), standar kuersetin 1.000 ppm (SIGMA), serbuk KBr, reagen MTT 0,5 mg/mL (Sigma Aldrich) dalam PBS (phospate buffer saline), MCF-7 cell lines, dimetilsulfoksida (DMSO), medium RPMI 1640 (Gibco) yang mengandung FBS 10% (Fetal Bovine Serum) (Gibco) dan penisilin-streptomisin 1% (Gibco).
33
Penggabungan fraksi yang memiliki kesamaan profil plot KLT
Fraksi-fraksi
‒ Kromatografi kolom
‒ Uji kemurnian KLT 2 dimensi dan titik leleh
a. Uji antioksidan metode penangkal radikal DPPH b. Uji antikanker sel MCF-7
metode MTT
34 3.4 Prosedur Penelitian
Metode yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi fraksinasi ekstrak kasar n-heksana secara kromatografi, uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH free radical scavenging, uji antikanker terhadap sel MCF-7 menggunakan metode MTT serta karakterisasi struktur dengan metode spektroskopi menggunakan instrumen UV-Vis, FTIR, LC/ESI-MS/MS, dan NMR.
3.4.1 Isolasi dan Pemurnian Senyawa
Ekstrak kasar n-heksana kulit batang G. maingayi yang diperoleh sebesar 24,38 g dari 1,5 kg sampel kering.
3.4.1.1 Kromatografi Kolom Gravitasi
Ekstrak n-heksana diambil sebanyak 20 g kemudian diimpregnasi menggunakan silika gel 60 (35-70 mesh). Selanjutnya disiapkan kolom yang telah bersih dan diisi dengan silika gel 60 (70-230 mesh) sebagai fase diam. Sampel hasil impregnasi diletakkan di atas kolom yang kemudian dielusi dengan komponen pelarut (n-heksana:EA:MeOH) gradien 10%. Hasil elusi dari tiap pelarut ditampung dalam botol 100 mL kemudian dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator.
Setiap fraksi yang diperoleh, dilihat profil noda yang terbentuk menggunakan kromatografi lapis tipis GF254, kemudian fraksi yang memiliki kesamaan bercak noda digabungkan. Proses kromatografi kolom gravitasi ditunjukkan pada Gambar 13.
35 Gambar 13. Kromatografi kolom gravitasi
3.4.1.2 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memantau hasil pemisahan kromatografi kolom. Setiap fraksi hasil pemisahan ditotolkan pada garis plat KLT GF254, lalu ditempatkan dalam chamber berisi eluen berupa campuran pelarut yang sesuai. Visualisasi noda hasil pengembangan selanjutnya dilakukan dengan menggunakan lampu UV pada 𝜆 254 dan 366 nm. Plat hasil pengembangan selanjutnya disemprot dengan reagen penampak noda, pelarut H2SO4 5% (dalam metanol) yang selanjutnya dipanaskan pada hotplate untuk menampakkan bercak noda yang tidak terlihat jelas. Fraksi yang menunjukkan noda tunggal kemudian diuji kemurniannya.
3.4.2 Uji Kemurnian Senyawa
Uji kemurnian senyawa dilakukan pada senyawa yang telah menampakkan noda tunggal pada KLT. Uji kemurnian ini dilakukan dengan menggunakan metode KLT 2 dimensi dan uji titik leleh.
36 KLT 2 Dimensi
Fraksi tunggal ditotol pada bagian bawah plat KLT silika gel 60 dengan ukuran persegi (5 cm x 5 cm), kemudian dielusi pada arah I menggunakan campuran pelarut n-heksana:etil asetat (8:2) dan dielusi kembali pada arah II (90˚ tegak lurus dari arah I) menggunakan diklorometana:metanol (95:5). Bercak yang tampak, dilihat di bawah lampu UV pada 𝜆 254 nm.
Pengujian Titik Leleh
Fraksi yang berbentuk kristal atau serbuk diambil, dan diamati titik lelehnya menggunakan melting point Fisher Scientific. Indikator suatu senyawa dikatakan murni apabila senyawa murni tersebut memiliki rentang suhu mulai meleleh hingga meleleh seluruhnya sebesar ±1-2 ˚C.
3.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Radical Scavanger DPPH Uji aktivitas antioksidan dilakukan terhadap ekstrak kasar n-heksana dan isolat murni dengan metode radical scavenging DPPH. Senyawa pembanding yang digunakan sebagai kontrol positif adalah kuersetin.
Pembuatan larutan stok DPPH 0,04%
Serbuk DPPH ditimbang sebayak 4 mg dilarutkan dalam 10 mL metanol, dan ditempatkan dalam botol gelap yang tertutup rapat lalu dihomogenkan menggunakan vortex.
Pembuatan Larutan Blangko
Larutan blangko dibuat dengan perlakuan yang sama dengan larutan uji, namun tanpa penambahan isolat sampel. Larutan blangko dibuat dari 2 mL metanol
37 yang ditambahkan 500 μL larutan DPPH 0,04% ditempatkan dalam tabung reaksi, lalu dihomogenkan dan diinkubasi selama 30 menit di ruangan gelap.
Pembuatan Larutan Pembanding (Standar)
Larutan pembanding (standar) dibuat dengan melarutkan 4 mg kuersetin dalam 4 mL metanol (1.000 μg/mL). Selanjutnya dari larutan pembanding kuersetin 1.000 μg/mL, diambil sebanyak 2,5; 12,5; dan 25 μL dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi yang berbeda, sehingga diperoleh konsentrasi 1, 5, dan 10 μg/mL.
Selanjutnya, ke dalam masing-masing tabung reaksi ditambahkan 500 μL larutan DPPH 0,04%, dihomogenkan dan diinkubasi dalam ruang gelap selama 30 menit dan dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum 𝜆 515 nm dan dihitung persen inhibisinya.
Pembuatan Larutan Uji
Larutan uji dibuat menggunakan sampel isolat murni GM-1. Larutan induk isolat murni dibuat dengan melarutkan 4 mg sampel dalam 4 mL metanol (1.000 μg/mL), kemudian dari larutan induk (1.000 μg/mL) diambil sebanyak 25 μL, 125μ L, dan 250 μ L dimasukkan ke dalam tabung reaksi, sehingga diperoleh konsentrasi 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 200 μg/mL. Selanjutnya, ke dalam masing-masing tabung reaksi ditambahkan 500 μL larutan DPPH 0,04% dihomogenkan menggunakan vortex, lalu diinkubasi dalam ruang gelap selama 30 menit dan dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum 𝜆 515 nm dan dihitung persen inhibisinya.
38 Analisis Data
Aktivitas antioksidan sampel dianalisis menggunakan perhitungan persentase penghambatan terhadap radikal DPPH atau persen inhibisi (Lampiran 1 dan 2) sesuai dengan persamaan 1 berikut:
% Inhibisi = Absorbansi blanko − Absorbansi sampel
Absorbansi blangko x 100……… (1)
Nilai IC50 ditentukan menggunakan persamaan regresi linier y = ax + b, dimana y adalah % inhibisi yang bernilai 50, a (slope) dan b (intercept) didapat dari kurva regresi linier dengan cara memplotkan % inhibisi sebagai sumbu y dan konsentrasi sampel sebagai sumbu x serta x adalah konsentrasi sampel yang akan ditentukan nilai IC50 (Molyneux, 2004).
3.4.4 Uji Antikanker dengan Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida]
Uji aktivitas antikanker dilakukan secara in vitro terhadap sel MCF-7 menggunakan metode MTT. Uji ini dilakukan terhadap senyawa murni hasil isolasi.
Pembuatan Larutan Uji
Larutan uji dibuat menggunakan isolat murni GM-1. Isolat murni sebanyak 2 mg dilarutkan dalam 2 mL DMSO(p) dan dihomogenkan menggunakan vortex sebagai larutan induk 1000 μg/mL. Selanjutnya, dari larutan induk tersebut dibuat pengenceran menggunakan DMSO 0,5% dalam seri konsentrasi 1, 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 μ g/mL. Variasi konsentrasi tersebut ditempatkan dalam tabung reaksi.
Selain itu, digunakan medium kultur berupa medium RPMI yang mengandung 10%
FBS (Fetal Bovine Serum) dan 1% penisilin-streptomisin sebagai kontrol media (tanpa sel).
39 Uji Antikanker
Uji antikanker dilakukan dalam plat 96 sumuran (96-well plate) sebagai media uji. Sebanyak 100 μ L suspensi sel kanker payudara (MCF-7) dengan kepadatan 104 sel/100 μL medium dimasukkan ke dalam tiap sumuran pada 96 well- plate dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 ˚C selama 24 jam.
Setelah diinkubasi, sel akan melekat pada dasar plat, lalu medium dibuang.
Selanjutnya ditambahkan 100 μ L isolat murni dengan berbagai konsentrasi ke dalam tiap sumuran yang telah berisi 100 μL suspensi sel dalam 100 μL medium.
Sebagai kontrol medium ditambahkan 100 μL medium kultur ke dalam sumuran tanpa penambahan isolat dan sebagai kontrol sel ditambahkan 100 μL medium kultur ke dalam sumuran yang berisi 100 μL suspensi sel. Larutan uji isolat, kontrol media, dan kontrol sel dilakukan secara triplo. Kemudian diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 ˚C selama 24 jam. Sel diamati dengan menggunakan mikroskop. Medium dalam tiap sumuran dibuang dan ditambahkan 100 μL PBS lalu dibuang. Setelah itu, tiap sumuran ditambahkan 10 μL MTT 0,5 mg/mL dan 100 μL medium kultur, termasuk kontrol media (tanpa sel) dan kontrol sel. Kemudian diinkubasi selama 2-4 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37
˚C. Sel dikeluarkan dari inkubator dan diamati dengan menggunakan mikroskop.
Jika kristal formazan ungu telah jelas terbentuk, reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 μL DMSO(p) kedalam masing-masing sumuran, lalu dibungkus menggunakan aluminium foil dan diinkubasi selama 10-15 menit pada suhu kamar dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu.
Absorbansi warna ungu dibaca menggunakan microplate reader pada 𝜆 550 nm dan dihitung persentase sel yang hidup.
40 Analisis Data
Persen sel yang hidup (viabilitas) pada isolat GM-1 dapat dihitung dengan persamaan (2) atau dapat dilihat pada Lampiran 3.
% Sel hidup = Absorbansi sampel − Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol sel − Absorbansi kontrol media x 100………(2) Perhitungan persen inhibisi ekstrak kasar dilakukan sesuai persamaan berikut (Zare et al., 2012):
% Inhibisi = 100 - % sel hidup………..(3)
Nilai IC50 ditentukan menggunakan persamaan regresi linier logarima y = ax +b, dimana y adalah % viabilitas yang bernilai 5, a (slope) dan b (intercept)
didapat dari kurva regresi linier hubungan antara logaritma konsentrasi sampel sebagai sumbu x dengan % sel hidup sebagai sumbu y. serta x merupakan konsentrasi sampel yang dinyatakan sebagai nilai IC50 (Kiso et al., 2001; Lancaster et al., 1995).
3.4.5 Penentuan Struktur
3.4.5.1 Analisis dengan Spektroskopi UV-Vis
Sampel murni sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 1 mL metanol (1.000 ppm), lalu dilakukan pengenceran dengan cara diambil sebanyak 0,3 mL dari larutan 1.000 ppm dan ditambahkan dengan 3 mL metanol (100 ppm). Sebanyak 3 mL sampel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 200-400 nm yang bertujuan untuk mengetahui serapan maksimum sampel.
3.4.5.2 Analisis dengan Spektroskopi FTIR
Sampel murni diambil 2 mg dan digerus dengan serbuk KBr. Campuran homogen yang sudah terbentuk, dibentuk pelet dengan menggunakan alat pembuat
41 pelet dan kemudian diukur serapannya menggunakan spektrometer IR pada bilangan gelombang 500-4.000 cm-1 untuk mengetahui gugus fungsi yang terdapat dalam sampel (Viviyanti dan Ersam, 2015).
3.4.5.3 Analisis dengan Spektroskopi LCMS/MS
Senyawa murni diambil sebanyak 2 mg dan dilarutkan dalam 1 mL metanol (2.000 ppm). Kemudian diencerkan dengan cara diambil 100 μL dari konsentrasi sebelumnya (2.000 ppm) dan ditambahkan dengan 1 mL metanol sehingga konsentrasinya menjadi 200 ppm. Selanjutnya sebanyak 1 μL larutan sampel (200 ppm) dimasukkan ke dalam syringe lalu diinjeksikan pada alat LC/ESI-MS/MS untuk mengetahui waktu retensi dan bobot molekul senyawa murni. Kondisi alat LC/ESI-MS/MS ditunjukkan pada Tabel 4.
Tabel 4. Kondisi LC/ESI-MS/MS untuk identifikasi isolat GM-1
Kondisi Parameter
Tipe ionisasi Electrospray Ionization (ESI)
Polaritas Ion positif
3.4.5.5 Analisis dengan Spektroskopi NMR
Senyawa murni yang diperoleh diambil sebanyak 20 mg dan dilarutkan dalam 0,5 mL pelarut bebas proton (CDCl3). Larutan sampel dimasukkan dalam tabung injection kemudian diletakkan dalam alat spektrometer NMR pada 400 MHz untuk 1H-NMR dan 100 MHz untuk 13C-NMR (Purbowati dan Ersam, 2017).
42 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi dan Pemurnian Senyawa dari Kulit Batang G. maingayi
Isolasi senyawa bahan alam dilakukan untuk memperoleh senyawa murni serta bahan aktif dari suatu ekstrak. Tahap isolasi ini diawali dengan melihat profil noda dari ekstrak n-heksana kulit batang G. maingayi dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Ekstrak n-heksana kulit batang G. maingayi yang ditunjukkan pada Gambar 14, memiliki ciri fisik berupa pasta kental yang lengket dan berwarna cokelat kekuningan.
Gambar 14. Ekstrak n-heksana kulit batang G. maingayi
Metode KLT pada tahap isolasi ini menggunakan plat silika gel 60 F254
sebagai fase diam dan pelarut n-heksana serta etil asetat sebagai fase gerak dengan berbagai perbandingan. Selain bertujuan untuk melihat profil noda dari ekstrak, penggunaan KLT yang dilakukan sebelum tahap fraksinasi ini juga dilakukan untuk mengetahui perbandingan pelarut yang sesuai untuk proses pemisahan. Menurut Aljamali et al. (2015), pemisahan yang baik menunjukkan jarak antara noda satu dengan yang lainnya tepisah atau tidak berhimpit. Hasil profil noda dari ekstrak
43 n-heksana kulit batang G. maingayi menggunakan berbagai perbandingan eluen n-heksana:etil asetat ditunjukkan pada Gambar 15.
Gambar 15. Hasil KLT ekstrak kulit batang G. maingayi berbagai perbandingan pelarut (n-heksana:EA), (A) n-heksana 100%, (B) 9:1, (C) 8:2, (D) 7:3
Hasil KLT pada lampu UV λ 254 nm dan 366 nm dengan keempat perbandingan eluen n-heksana dan etil asetat (Gambar 15) menunjukkan pola pemisahan yang berbeda sesuai dengan kemampuan terbawanya komponen ekstrak sampel dalam fase geraknya. Pola pemisahan yang kurang baik ditunjukkan oleh keempat perbandingan eluen. Komponen senyawa dalam ekstrak kurang terbawa (terelusi) oleh fase gerak n-heksana 100%, diduga karena senyawa-senyawa yang terdapat dalam ekstrak sampel merupakan golongan senyawa semipolar yang berbeda tingkat kepolarannya dengan eluen n-heksana (non-polar). Pemisahan noda pada eluen n-heksana:EA (9:1) menunjukkan pola pemisahan yang lebih baik (terbentuk empat noda terpisah di bagian atas plat KLT) bila dibandingkan eluen n-heksana 100%, namun noda pada bagian bawah berbentuk tailing (ekor) sehingga pemisahannya kurang sempurna. Noda yang berdekatan dan tailing (ekor) yang merupakan tanda pemisahan yang kurang sempurna juga terjadi ketika kepolaran eluen n-heksana:etil asetat ditingkatkan menjadi 8:2 dan 7:3.
A B C D λ 254 nm
A B C D λ 365 nm
44 Hasil pemisahan noda pada KLT yang tidak sempurna menjadikan pemilihan sistem eluen untuk proses fraksinasi dilakukan secara gradien (dimulai dari pelarut non polar terlebih dahulu dan selanjutnya ditingkatkan polaritas dari pelarut tersebut) (Gibbons, 2012). Hasil KLT juga menunjukkan bahwa komponen senyawa pada ekstrak n-heksana kulit batang G. maingayi ini tidak terlalu banyak (kompleks). Hal ini ditunjukkan dari profil noda yang terbentuk pada KLT dari ketiga perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat (9:1), (8:2), dan (7:3), terlihat ada empat noda yang terpisah di bagian atas plat KLT dan satu noda dominan di bagian bawah plat KLT. Noda yang tidak terlalu kompleks menjadi dasar pemilihan penggunaan kromatografi kolom gravitasi (KKG) sebagai metode fraksinasi senyawa dari ekstrak n-heksana kulit batang G. maingayi.
Ekstrak sampel kulit batang G. maingayi difraksinasi menggunakan kromatografi kolom. Tiap hasil fraksinasi ditampung dalam 22 botol vial yang kemudian masing-masing dari botol vial tersebut dilihat profil nodanya. Hasil KLT dari 22 fraksi tersebut ditunjukkan pada Gambar 16.
Gambar 16. Profil noda hasil fraksinasi
H:EA (9:1) H:EA (8:2) H:EA (8:2)
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 F17 F18 F19 F20 F21 F22 1A
2B 3C
4D
5E
6F
45 Fraksi yang menunjukkan profil noda serupa digabungkan dan dihasilkan 6 fraksi (1A, 2B, 3C, 4D, 5E, dan 6F) (Gambar 16). Keenam fraksi tersebut dibiarkan kering dan ditimbang. Berat masing-masing fraksi yaitu 1A (3,21 g), 2B (2,77 g), 3C (1,92 g), 4D (4,45 g), 5E (2,18 g), dan 6F (0,88 g). Keenam fraksi hasil gabungan dilihat profil nodanya menggunakan KLT dan dielusi menggunakan perbandingan eluen n-heksana:etil asetat (8:2 dan 7:3) seperti ditunjukkan Gambar 17. Pemilihan eluen didasarkan dari penggunaan pelarut saat proses fraksinasi dalam kolom.
Gambar 17. Hasil KLT fraksi 1A-6F
Hasil analisis KLT keenam fraksi (1A-6F) menunjukkan adanya noda yang selalu muncul (noda dominan) pada masing-masing fraksi pada Gambar 17 (ditunjukkan oleh lingkaran hitam). Noda dominan tersebut dijadikan target pada proses pemisahan lebih lanjut. Berdasarkan hasil KLT, posisi noda target yang mudah dipisahkan yaitu fraksi 5E. Bila dibandingkan dengan fraksi lain, noda pada fraksi 5E yang dilihat menggunakan lampu UV baik pada 𝜆 254 dan 366 nm menunjukkan 3 noda. Posisi noda target pada fraksi 5E (noda paling atas plat KLT)
H:EA (8:2)
H:EA (7:3) H:EA (8:2)
H:EA (7:3)
46 terpisah sempurna dengan noda yang terdapat dibawahnya (2 noda lainnya) serta tidak nampak noda lain diatasnya. Noda target tersebut juga tampak pada fraksi 3C dan 4D yang diamati menggunakan lampu UV 𝜆 254 nm, akan tetapi ketika dilihat menggunakan lampu UV 𝜆 366 nm, masih tampak noda lain di atas noda target tersebut. Hal yang sama juga terlihat pada fraksi 1A, 2B, dan 6F (Gambar 17).
Noda target pada fraksi 5E (2,18 g) selanjutnya dilakukan proses pemisahan lebih lanjut dengan menggunakan kromatografi kolom. Berdasarkan hasil KLT noda target terpisah menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (8:2), sehingga proses pemisahan pada kolom juga menggunakan komposisi pelarut yang sama (n-heksana:EA) dengan perbandingan 9:1 dan proses elusi dilakukan secara isokratis.
Hal ini bertujuan agar senyawa yang terdapat dalam fraksi keluar secara perlahan dan terpisah dengan baik. Hasil pemisahan fraksi 5E menghasilkan 19 subfraksi yang dinamakan dengan 5E.1-5E.19 berturut-turut. Profil noda dari 19 subfraksi tersebut dianalisis menggunakan KLT dengan eluen n-heksana:etil asetat (8:2) ditunjukkan pada Gambar 18.
Gambar 18. Profil noda subfraksi 5E.1-5E.19
Profil noda yang sama dari 19 subfraksi (5E.1-5E.19) selanjutnya digabungkan. Subraksi 5E.1- 5E.5 digabungkan menjadi satu fraksi (Gambar 18)
B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
n-heksana:etil asetat (8:2) GM-1
GM-2
GM-3
47 dan diberi nama fraksi GM-1, sementara subfraksi 5E.6-5E.13 dan 5E.14-5E.15 digabungkan berturut-turut menjadi fraksi GM-2 dan GM-3. Fraksi GM-1 merupakan noda target dan menghasilkan noda tunggal, sementara fraksi GM-2 dan GM-3 masih terbentuk 2 noda. Fraksi GM-1 dengan noda tunggal selanjutnya diuji kemurniannya dengan KLT 2 dimensi serta uji titik leleh.
4.2 Uji Kemurnian Senyawa
Fraksi GM-1 yang menunjukkan noda tunggal saat KLT dan diduga telah murni, diuji kemurniannya menggunakan metode KLT 2 dimensi serta pengujian titik leleh. Uji kemurnian metode KLT 2 dimensi dilakukan melalui 2 sistem elusi dengan menggunakan pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya. Elusi pertama dilakukan menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (8:2) dan elusi kedua menggunakan eluen diklorometana:metanol (95:5). Hasil KLT 2 dimensi fraksi GM-1 ditunjukkan pada Gambar 19.
Gambar 19. Hasil KLT 2 dimensi fraksi GM-1
48 Berdasarkan hasil KLT 2 dimensi (Gambar 19) dan pengamatan di bawah lampu UV 𝜆 254 dan 366 nm noda tunggal terlihat saat proses elusi pertama menggunakan n-heksana:EA (8:2). Noda tunggal juga diperlihatkan pada proses elusi kedua menggunakan eluen diklorometana:metanol (95:5), baik pada UV 𝜆 254 maupun 366 nm (Gambar 19). Noda tunggal yang terbentuk pada 2 sistem elusi mengindikasikan bahwa fraksi GM-1 telah murni. Tujuan penggunaan 2 sistem elusi ini adalah untuk melihat apakah masih terdapat noda lain yang berbeda kepolarannya dengan noda target. Fraksi GM-1 yang telah murni selanjutnya dibiarkan kering dan ditimbang. Fraksi GM-1 yang diperoleh berupa kristal jarum berwarna kuning pucat dengan berat 107,2 mg dan diberi nama isolat GM-1.
Visualisasi isolat GM-1 ditunjukkan pada Gambar 20.
Gambar 20. Visualisasi isolat GM-1
Isolat GM-1 juga diuji kemurnian menggunakan metode lain, yaitu dengan uji titik leleh. Titik leleh isolat GM-1 yaitu 122-124˚C yang bisa dikatakan isolat GM-1 merupakan senyawa murni. Suatu senyawa bisa dikatakan murni bila rentang titik leleh sebesar 1-2˚C (Husni et al., 2016).
4.3 Penentuan Struktur Isolat GM-1
Penentuan struktur isolat GM-1 dilakukan menggunakan instrumen UV-Vis, FTIR, NMR, serta LCMS/MS.
49 4.3.1 Analisis Data UV-Vis
Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk mengetahui gugus kromofor yang terdapat dalam isolat GM-1. Hasil analisis spektroskopi UV-Vis isolat GM-1 dengan pelarut metanol pada rentang panjang gelombang 200-600 nm (Gambar 21) menunjukkan adanya 2 pita serapan. Pita serapan kuat (Pita I) pada panjang gelombang maksimum (𝜆maks) 251 nm dan pita serapan lemah (Pita II) pada 𝜆maks
355 nm. Pita serapan pada 𝜆maks 251 nm menunjukkan adanya transisi elektron (eksitasi) gugus kromofor dari orbital π → π* ikatan rangkap (–C=C–) pada senyawa aromatik benzena, sedangkan pita serapan lemah pada panjang gelombang yang lebih besar 𝜆maks 355 nm mengindikasikan adanya transisi elektron dari orbital n → π* senyawa karbonil yang terkonjugasi pada senyawa aromatik (–C=C–C=O) (Supratman, 2010).
Gambar 21. Spektrum UV-Vis isolat GM-1
4.3.2 Analisis Data FTIR
Spektroskopi FTIR digunakan untuk mengetahui gugus fungsi apa saja pada isolat GM-1. Hasil analisis FTIR isolat GM-1 ditunjukkan pada Gambar 22.
251 nm
355 nm
50 Gambar 22. Spektrum FTIR isolat GM-1
Berdasarkan data spektrum FTIR, isolat GM-1 menunjukkan adanya beberapa gugus fungsi. Interpretasi lebih lanjut terhadap gugus fungsi isolat GM-1 dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil analisis gugus fungsi isolat GM-1
Bilangan gelombang (cm-1) Perkiraan gugus fungsi
3564; 3274 O-H (regang)
2969 dan 2872 -CH3 (regang)
2923 C-H aromatik
1728; 1623 C=O (regang)
1529 C=C aromatik (regang)
1435 C-H (tekuk)
1298 C-O alkohol atau fenol (regang)
Analisis spektrum FTIR (Tabel 5) isolat GM-1 menunjukkan adanya serapan tajam dengan intensitas lemah pada bilangan gelombang 3.564 cm-1 dan serapan melebar pada 3.274 cm-1menandakan adanya gugus OH yang dikuatkan dengan adanya gugus C-O pada daerah 1.298 cm-1. Adapun serapan pada bilangan gelombang 2.969 cm-1 dan 2.872 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi regang dari gugus metil (CH3). Vibrasi regang pada bilangan gelombang 2.923 cm-1
O-H C-H
C=O
C-O C=C C-H
51 menandakan adanya gugus C-H aromatik yang didukung dengan adanya vibrasi regang C=C pada daerah bilangan gelombang 1.529 cm-1. Vibrasi regang gugus metil (-CH3) ditunjukkan pada daerah 2.969 cm-1 yang dikuatkan dengan adanya vibrasi tekuk C-H pada 1.435 cm-1. Berdasarkan analisis spektrum FTIR menunjukkan bahwa isolat GM-1 mengandung gugus aromatik, gugus OH, serta gugus karbonil (C=O). Adanya gugus –OH serta –C=C- aromatik yang terkonjugasi pada cincin aromatik ini mengindikasikan gugus yang potensial sebagai agen antioksidan (Bors et al., 1990).
4.3.3 Analisis Data LC/ESI-MS/MS
Hasil analisis LC/ESI-MS-MS terhadap isolat GM-1 menunjukkan adanya puncak tunggal pada waktu retensi (tR) 8,15 menit (Gambar 23).
Gambar 23. Kromatogram isolat GM-1
Informasi lain dari analisis LC/ESI-MS/MS ini yaitu berupa spektrum massa yang menunjukkan berat molekul dari senyawa isolat GM-1 (Gambar 24).
52 Gambar 24. Spektrum massa isolat GM-1
Gambar 24 merupakan spektrum massa dari isolat GM-1, dan menunjukkan ion molekul [M+Na]+ dan [M+H]+ isolat GM-1 secara berturut-turut pada m/z 625,3 dan 603,3 yang berarti bahwa berat molekul isolat GM-1 yaitu 602,3. Berat molekul tersebut sesuai dengan rumus molekul C38H50O6 dan diindikasikan sebagai senyawa
Gambar 24 merupakan spektrum massa dari isolat GM-1, dan menunjukkan ion molekul [M+Na]+ dan [M+H]+ isolat GM-1 secara berturut-turut pada m/z 625,3 dan 603,3 yang berarti bahwa berat molekul isolat GM-1 yaitu 602,3. Berat molekul tersebut sesuai dengan rumus molekul C38H50O6 dan diindikasikan sebagai senyawa