Spektroskopi

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

3. Spektroskopi

Molekul dapat berada pada berbagai tingkat energi. Proses dalam suatu ikatan molekul terkuantisasi, artinya ikatan dapat meregang, bengkok, atau berotasi hanya pada frekuensi tertentu dan elektron hanya dapat bergerak diantara orbital-orbital dengan selisih energi tertentu. Selisih energi/frekuensi inilah yang terukur lewat berbagai jenis spektrum. Spektrum terdiri atas rekaman atau plot dari banyaknya energi radiasi yang diterima oleh detektor sewaktu energi asupannya divariasikan secara berangsur-angsur (Hart, 2003).

13

a. Spektroskopi ultra ungu (Ultra Violet Spectroscopy)

Metode spektroskopi ultra ungu berdasarkan penyerapan sinar oleh larutan tak berwarna, dimana energi cahaya terserap digunakan untuk transisi elektron. Panjang gelombang cahaya ultra violet maupun cahaya tampak tergantung pada mudahnya transisi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk transisi elektron akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah tampak (senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih mudah ditransisikan daripada senyawa yang menyerah pada panjang gelombang ultra violet yang lebih pendek (Fessenden, 1990).

Geseran batokhromik adalah geseran dari serapan ke panjang gelombang lebih panjang karena pengaruh pelarut (geseran merah). Geseran batokhromik sering diikuti dengan bertambahnya intensitas dan bertambahnya polaritas dari pelarut. Geseran merah dihasilkan dari suatu penurunan tingkat energi dari tingkat tereksitasi disertai dengan interaksi dwikutub-dwikutub dan ikatan hidrogen. Pita-B (pita benzenoid) adalah khas pita aromatik atau heteroaromatik. Bila suatu gugus khromoforik menempel pada suatu cincin aromatik, pita-B terlihat pada panjang gelombang yang lebih panjang daripada transisi π π* yang lebih kuat (Silverstein, 2003).

Benzena dan senyawa aromatik memperlihatkan spektra yang lebih kompleks karena adanya beberapa keadaan eksitasi rendah. Sering panjang gelombang 260 nm dilaporkan sebagai λmax untuk benzena. Absorpsi radiasi ultra violet oleh senyawa aromatik yang terdiri dari cincin benzena terpadu bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang dengan bertambah banyaknya cincin benzena karena bertambahnya konjugasi dan memperbesarnya stabilisasi resonansi dari keadaan eksitasi (Fessenden, 1990).

b. Inframerah (IR)

Spektroskopi inframerah (IR) merupakan salah satu teknik spektroskopi yang paling umum digunakan dalam analisa organik maupun anorganik. Tujuan utama dari analisis spektroskopi IR adalah untuk menentukan gugus fungsional dalam sampel. Gugus-gugus fungsional menyerap karakteristik frekuensi yang berbeda pada radiasi

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

IR (lihat Tabel 2) . Spektrometer IR dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel seperti gas, cairan, dan padatan (Hsu, 1997).

Inframerah biasa terukur pada kisaran antara 700-5000 cm^-1 yang sama dengan energi sekitar 2-12 kkal/mol. Jumlah energi ini cukup untuk mempengaruhi getaran (vibrasi) ikatan tetapi sangat kurang untuk memutuskan ikatan (Hart, 2003).

Tabel 2. Serapan yang Spesifik pada Spektra IR Berdasarkan Gugus Fungsional

Gugus Jenis Senyawa Daerah Serapan (cm^-1)

C – H Alkana 2850 – 3000

= C – H Alkena dan senyawa aromatik 3030 – 3140

≡ C – H Alkuna 3300

O – H Alkohol dan fenol ^{3500 – 3700 (bebas)}

3200 – 3500 (berikatan hidrogen)

O – H Asam karboksilat 2500 – 3000

C = C Alkena 1600 – 1680

C = O Aldehida, keton, ester, asam 1650 – 1780

C ≡ C Alkuna 2100 – 2260

(Hart, 2003) Dua daerah serapan penting dalam pemeriksaan awal sebuah spektrum ialah daerah 4000 – 1300 cm^-1 dan daerah 909 – 650 cm^-1. Bagian serapan tinggi sebuah spektrum disebut sebagai daerah gugus fungsi. Serapan khas bagi gugus-gugus fungsi yang penting seperti OH, NH, dan C=O terletak pada bagian tersebut. Ketiadaan serapan pada daerah gugus-gugus tertentu biasanya dapat digunakan sebagai bukti bahwa molekul itu tidak mempunyai gugus-gugus tersebut. Namun, dalam menafsirkannya harus berhati-hati karena suatu struktur tertentu dapat menyebabkan sebuah pita menjadi luar biasa lebar sehingga tidak terartikan. Pada umumnya, ketiadaan serapan kuat di daerah 909 – 650 cm^-1 menunjukkan suatu struktur niraromatik. Senyawa-senyawa aromatik dan heteroaromatik menunjukkan pita serapan kuat C–H di daerah tersebut. Bagian tengah spektrum, yaitu 1300 – 909 cm^-1 biasanya disebut sebagai daerah sidik jari. Serapan di daerah ini seringkali rumit dengan pita-pita yang ditimbulkan oleh getaran yang berantaraksi (Silverstein, 2005). c. Spektroskopi ¹H resonansi magnetik inti (¹H NMR)

Spektroskopi NMR didasarkan pada spektroskopi absorpsi, seperti pula pada spektroskopi IR ataupun UV. Sampel dapat menyerap radiasi elektromagnetik pada daerah frekuensi radio. Pola spektra berupa alur antara absorbansi (A) terhadap ^{commit to user}

15

pergeseran kimia (δ). Pelarut ideal yang digunakan adalah pelarut yang tidak mengandung proton, pelarut inert, titik didih rendah dan murah. Kloroform deuterasi (CDCl3) banyak digunakan karena dapat memperkecil kemungkinan terganggunya pergeseran kimia yang diakibatkan pengotor dari CHCl3 (Silverstein, 2005).

Pada dasarnya spektroskopi ¹H NMR dapat memberi jenis informasi struktural mengenai atom-atom hidrogen dalam sebuah molekul organik. Banyaknya sinyal dan pergeseran kimianya dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis inti ¹H yang secara kimia berbeda di dalam molekul. Luas puncak menginformasikan banyaknya inti ¹H dari setiap jenis yang ada. Sedangkan pola pemisahan spin-spin menginformasikan tentang jumlah ¹H tetangga terdekat yang dimiliki oleh inti ¹H tertentu (Hart, 2003). Pergeseran kimia dapat dilihat pada Table 3.

Tabel 3. Pergeseran Kimia ¹H yang Khas

Jenis ¹H δ (ppm) Jenis ¹H δ (ppm) C ─CH3 0,85-0,95 _CH2=C 4,6-5,0 C─CH2─C 1,20-1,35 ─CH=C 5,2-5,7 HC C C C 1,40-1,65 C O H 9,5-9,7 CH3─C=C 1,6-1,9 ─CºC─H 2,4-2,7 CH₃─Ar 2,2-2,5 Ar─H 6,6-8,0 C O CH₃ 2,1-2,6 C O OH 10-13 CH₃─O 3,5-3,8 ^R─OH 0,5-5,5 Ar─OH 4-8 (Hart, 2003) Selisih letak serapan proton tertentu terhadap proton acuan dinamakan geseran kimia proton. Suatu sistem 3 kelompok proton yang masing-masing saling terpisah oleh beda geseran kimia besar dapat dilambangkan AMX. Jika 2 kelompok terpisah geseran kimia kecil sedangkan kelompok ketiga jauh terpisah dari 2 kelompok lainnya, sistem disebut ABX. Jika geserannya berdekatan, ikatan sebagai ABC (Silverstein, 2005). Spektrum dari A1 santon (26) memperlihatkan sistem ABX dan spektru dari metil 2-furoat (27) memperlihatkan sistem AMX.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

(26) (27) Gambar 9. Sistem AMX dan ABX

d. Liquid Chromatography – Mass Spectroscopy (LC-MS)

Kromatografi adalah metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi antara dua fase, yaitu fase stasioner dan fase gerak. Fase gerak dapat berupa cairan atau gas, sedangkan fase diam dapat berupa padat, gel atau cairan. Dari perspektif kualitatif, keterbatasan utama dari kromatografi dalam isolasi adalah ketidakmampuan untuk mengidentifikasi secara pasti suatu komponen campuran. Identifikasi ini didasarkan pada perbandingan karakteristik retensi, menyederhanakan waktu retensi, dan penentuan komponen dengan melihat referensi komponen senyawa pada kondisi sama. Keuntungan spektrometri massa terletak pada banyaknya senyawa yang cukup spesifik terhadap spektrum massa untuk memungkinkan identifikasi komponen dengan tingkat kepercayaan tinggi. Spektrum massa yang diperoleh akan mengandung ion dari semua senyawa yang ada. Kombinasi dari pemisahan kromatografi menguntungkan karena banyak senyawa dengan karakteristik retensi identik yang memiliki spektrum massa sangat berbeda (Ardrey, 2003).

LC-MS dapat dipakai untuk sebagian besar senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi. Pemakaian spektrometer massa pada kromatografi kolom memungkinkan dalam pengukuran bobot molekul setiap komponen (dapat komponen murni maupun campuran) (Gritter, 1991).

Beberapa metode ionisasi yang biasa digunakan dalam LC-MS adalah ionisasi elektron (EI), ionisasi kimia (CI), bombardir atom-cepat (FAB), Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), Ionisasi Elektrospray (ESI) dan Ionisasi Termospray (TSP). J34 = 3.5 Hz J45 = 2 Hz J35 = 1 Hz O ^COCH3 O 1 2 4 3 5 7,24, d, J=7,95 7,70, dd, J=1,8; 7,95 7,26, d, J=1,8 O O OH H H HO H H H H O H H commit to user

17

1) Ionisasi Elektron (EI)

Dalam elektron ionisasi (EI), analit dalam fase uap dibombardir elektron berenergi tinggi (biasanya 70 eV) (1 ev = 1,602 177 33 ×10^-19 J). Molekul analit menyerap sebagian dari energi tersebut (biasanya sekitar 10 eV) untuk pembentukan ion. Hal tersebut menghasilkan kation radikal yang disebut ion molekuler (M⁺•) dan m/z yang sesuai dengan berat molekul analit. Sisa energi pembombardiran (60 eV) digunakan untuk fragmentasi. Interpretasi spektrum EI melibatkan signifikasi senyawa kimia dari ion yang diamati dalam spektrum massa dan kemudian menggunakan informasi ini untuk mendapatkan struktur.

2) Ionisasi Kimia (CI)

Ionisasi kimia (CI) adalah teknik yang telah dikembangkan secara khusus untuk mengurangi fragmentasi yang terkait dengan ionisasi. Dalam hal ini, molekul analit dalam fase uap dimasukkan ke sumber spektrometer massa yang mengandung gas pereaksi. Campuran ini kemudian dibombardir elektron (seperti pada EI) dan ionisasi terjadi. Reaksi ion molekul terjadi antara ion pereaksi gas dan molekul-molekul analit netral dalam tekanan tinggi dari sumber spektrometer massa. Gas-gas pereaksi yang paling umum digunakan adalah metana dan amonia isobutana. Perlu diingat bahwa m/z dari ion yang teramati di ion molekuler tidak memberikan berat molekul secara langsung karena masih terdiri dari campuran analit.

3) Bombardir Atom-Cepat (FAB)

Bombardir Atom-Cepat (FAB) adalah salah satu dari sejumlah teknik ionisasi yang memanfaatkan bahan matriks, dimana analit dipisahkan guna mentransfer cukup energi untuk analit dalam pengionisasian. Dalam FAB, bahan matriks berupa cairan, seperti gliserol, dan energi untuk ionisasi digunakan atom energi tinggi (biasanya xenon). Ketika FAB dimanfaatkan untuk LC-MS, sering dikenal sebagai FAB-aliran berkelanjutan, materi matriks ditambahkan ke eluen HPLC (baik pra-kolom atau pasca-kolom) dan campuran ini terus menerus mengalir masuk ke dalam sumber spektrometer massa dimana materi matriks tersebut dibombardir oleh atom. Batas bobot molekul dalam FAB biasanya sekitar 10000 Da.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

4) Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

MALDI merupakan teknik yang belum digunakan secara luas untuk aplikasi LC-MS, namun MALDI memberikan informasi analisis pelengkap bagi LC-MS. MALDI bekerjasama dengan FAB dalam penggunaan matriks dimana transfer energi untuk molekul analit menggunakan ionisasi polar, suhu labil dan molekul dengan bobot molekul tinggi. Energi diperoleh dari getaran laser pada panjang gelombang yang dapat diserap oleh material matriks seperti asam nikotinat atau sinapinik. MALDI memiliki rentang massa senyawa yang dapat terionisasi lebih besar dari FAB, yaitu sekitar 500000 Da(Ardrey, 2003).

5) Ionisasi Termospray (TSP)

Pada metode termospray, larutan dimasukkan dan dipanaskan dalam pipa kapiler spektrometer massa. Metode ini dapat mengatasi kecepatan alir yang tinggi dan menyeimbangkan larutan pada permukaan spektrometer massa. Metode ini sebagian besar telah digantikan oleh elektrospray.

6) Ionisasi Elektrospray (ESI)

Sumber ion elektrospray (ES) dioperasikan pada atau mendekati tekanan atmosfer, sehingga dapat disebut sebagai ionisasi tekanan atmosfer atau API. Sampel berupa larutan (biasanya, pelarut polar yang mudah menguap) memasuki sumber ion melalui pipa kapiler stanless steel, yang dikelilingi oleh aliran co-aksial nitrogen yang disebut gas nebulizing. Aliran gas nebulizing langsung mengalir ke spektrometer massa. Larutan yang keluar dari pipa kapiler berupa aerosol. Tetesan dalam aerosol disemprot untuk menguapkan pelarut, sehingga konsentrat hanya berisi ion-ion. Ketika tolakan elektrostatik antara ion-ion muatan sampel mencapai titik kritis, tetesan mengalami “ledakan kolom”, dimana terjadi pelepasan ion-ion sampel ke dalam fase uap. Ion-ion fasa uap terfokus pada sejumlah lubang sampel dalam spektrometer massa (Silverstein, 2005).

Time-of-Flight (ToF) merupakan perangkat sederhana dalam sistem pemisahan. Sistem ini bergantung pada kenyataan bahwa jika semua ion yang dihasilkan dalam sumber spektrometer massa dengan teknik apapun diberi energi kinetik yang sama maka kecepatan masing-masing akan berbanding terbalik dengan akar kuadrat dari massa.^{commit to user} Waktu yang dibutuhkan bagi semua ion untuk

19

melintasi daerah medan bebas (tabung flight spektrometer massa) akan berkaitan dengan m/z dari ion. Dengan memvariasikan kondisi spektrometer massa, misalnya medan magnet, medan quadrupole, dan lain-lain; ion dengan nilai m/z berbeda dibawa ke detektor dan spektrum massa yang sesuai akan diperoleh. Dalam instrumen time-of-flight (Gambar 10), ion dari semua rasio m/z dalam sumber ion ditransfer secara bersamaan dan seketika masuk ke spektrometer massa, dengan demikian rasio m/z dapat ditentukan secara akurat.

Gambar 10. Skema time-of-flight spektrometer massa

Ion keluar dari sumber ion ke detektor 1, dan hanya memperoleh spektra resolusi rendah, sehingga diperlukan cara untuk meningkatan resolusi yang diperlukan agar memperoleh spektrum yang diinginkan. Resolusi analisa ToF tergantung pada kemampuan untuk mengukur perbedaan yang sangat kecil waktu yang dibutuhkan untuk ion m/z mencapai detektor. Peningkatan resolusi dilakukan dengan meningkatkan jarak perjalanan ion dari sumber ion ke detektor, yaitu dengan memperpanjang tabung flight, sehingga membuat instrumen secara fisik akan lebih besar. Oleh karena itu, digunakan satu atau lebih cermin ion, yang dikenal sebagai reflektron. Pencerminan sinar ion dengan reflektron tunggal menuju detektor 2 membuat jarak perjalanan ion menjadi dua kali lipat tanpa memperpanjang tabung flight. Keuntungan dari instrumen ToF selain kesederhanaannya, adalah kemampuan scanning yang cepat dan keterlibatan resolusi kromatografi tinggi (Ardrey, 2003).

Elektrospray digunakan untuk senyawa yang memiliki bobot molekul besar, misalnya protein, ion dengan bermacam bentuk senyawa penyusun. Protein dapat memiliki 40 atau lebih senyawa penyusun sehingga molekul mencapai 100 kDa dapat dideteksi pada kisaran quadrupole konvensional. Penampakan spektrum Ion source Ion beam ‘Light’ ions Flight tube Detector ‘1’ Detector ‘2’ Reflector + + + perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user

berupa serangkaian puncak massa yang sesuai dengan ion molekul yang kurang satu proton (Silverstein, 2005).