BAB III METODE PENELITIAN
3.9 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat dan bahan-bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada suhu 170oC selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen (Lay, 1994).
3.10 Pembuatan Media Untuk Bakteri Uji
3.10.1 Nutrient agar
Komposisi:
Bacto beef extract 3,0 g
Bacto peptone 5,0 g
Bacto agar 15,0 g
Air suling ad 1 L
Sebanyak 28 gram serbuk Nutrient Agar (NA) dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit (Difco, 1977).
3.10.2 Nutrient broth (NB)
Komposisi:
Bacto Beef Extract 3,0 g
Bacto Peptone 5,0 g
Air suling ad 1 L
Sebanyak 13 gram serbuk Nutrient Broth (NB) dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L
dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit (Difco, 1997).
3.10.3 Pembuatan agar miring
Ke dalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan membeku pada posisi miring membentuk sudut 45oC, kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5oC.
3.11 Pembuatan Stok Kultur Bakteri
3.11.1 Pembuatan stok kultur bakteri Echerichia coli
Satu koloni bakteri Echerichia coli diambil dengan jarum ose steril, lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 ± 1oC selama 24 jam (Depkes, 1995) a.
3.11.2 Pembuatan stok kultur bakteri Staphylococcus aureus
Satu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dengan jarum ose steril, lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 ± 1oC selama 24 jam (Depkes, 1995) a.
3.12 Pembuatan Inokulum Bakteri
3.12.1 Pembuatan inokulum bakteri Echerichia coli
Koloni bakteri Echerichia coli diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose steril, kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml larutan
Nutrient Broth (NB) steril lalu diinkubasikan pada suhu 37 ± 1oC sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25% menggunakan alat spektrofotometer visible coklat gelombang 580 nm ((Depkes, 1995) a.
3.12.2 Pembuatan inokulum bakteri Staphylococcus aureus
Koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose steril, kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml larutan
Nutrient Broth (NB) steril lalu diinkubasikan pada suhu 37 ± 1oC sampai
didapat kekeruhan dengan transmitan 25% menggunakan alat spektrofotometer visible coklat gelombang 580 nm (Depkes, 1995) a.
3.13 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Biji Pepaya
3.13.1 Pembuatan larutan uji ekstrak n-heksana biji pepaya
3.13.1.1 Larutan uji ekstrak n-heksana biji pepaya dari pepaya burung dengan berbagai konsentrasi
Sebanyak 1 g ekstrak n-heksana biji pepaya dari pepaya burung ditimbang, lalu ditambahkan DMSO 1 ml dan diaduk hingga larut, setelah itu ditambahkan aquabidest steril hingga volume total 2 ml lalu dihomogenkan, maka didapat konsentrasi 500 mg/ml, kemudian dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400, 300, 200,100, dan 50 mg/ml.
3.13.1.2 Larutan uji n-heksana biji pepaya dari pepaya coklat dengan berbagai konsentrasi
Sebanyak 1 g ekstrak n-heksana biji pepaya dari pepaya coklat ditimbang, lalu ditambahkan DMSO 1 ml dan diaduk hingga larut, setelah itu ditambahkan aquabidest steril hingga volume total 2 ml lalu dihomogenkan,
maka didapat konsentrasi 500 mg/ml, kemudian dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400, 300, 200,100, dan 50 mg/ml.
3.13.2 Pembuatan larutan uji ekstrak etanol biji pepaya
3.13.2.1 Larutan uji ekstrak etanol biji pepaya dari pepaya burung dengan berbagai konsentrasi
Sebanyak 1 g ekstrak etanol biji pepaya dari pepaya burung ditimbang, lalu ditambahkan DMSO 1 ml dan diaduk hingga larut, setelah itu ditambahkan aquabidest steril hingga volume total 2 ml lalu dihomogenkan, maka didapat konsentrasi 500 mg/ml, kemudian dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400, 300, 200,100, dan 50 mg/ml.
3.13.2.2 Larutan uji ekstrak etanol biji pepaya dari pepaya coklat dengan berbagai konsentrasi
Sebanyak 1 g ekstrak etanol biji pepaya dari pepaya coklat ditimbang, lalu ditambahkan DMSO 1 ml dan diaduk hingga larut, setelah itu ditambahkan aquabidest steril hingga volume total 2 ml lalu dihomogenkan, maka didapat konsentrasi 500 mg/ml, kemudian dibuat pengenceran dengan konsentrasi 400, 300, 200,100, dan 50 mg/ml.
3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri Terhadap Ekstrak
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap ekstrak n-heksana dan ekstrak etanol dari biji dua varietas pepaya dengan berbagai konsentrasi. Pengujian ini dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan punch hole.
3.14.1 Uji ekstrak n-heksana biji pepaya burung terhadap bakteri Echerichia coli
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45–50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak n-heksana dari biji pepaya burung dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37±1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
3.14.2 Uji ekstrak n-heksana biji pepaya burung terhadap bakteri Staphylococcus aureus
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45–50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak n-heksana dari biji pepaya burung dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37±1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
3.14.3 Uji ekstrak n-heksana biji pepaya coklat terhadap bakteri Echerichia coli
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45–50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan
pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak n-heksana dari biji pepaya coklat dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37±1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
3.14.4 Uji ekstrak n-heksana biji pepaya coklat terhadap bakteri Staphylococcus aureus
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45–50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak n-heksana dari biji pepaya coklat dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 ± 1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
3.14.5 Uji ekstrak etanol biji pepaya burung terhadap bakteri Echerichia coli
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45-50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak etanol dari biji pepaya burung dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37±1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah
hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
3.14.6 Uji ekstrak etanol biji pepaya burung terhadap bakteri Staphylococcus aureus
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45–50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak etanol dari biji pepaya burung dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37±1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
3.14.7 Uji ekstrak etanol biji pepaya coklat terhadap bakteri Echerichia coli
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45–50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak etanol dari biji pepaya coklat dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37±1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
3.14.8 Uji ekstrak etanol biji pepaya coklat terhadap bakteri Staphylococcus aureus
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45–50oC, lalu dihomogenkan. Pada media yang telah padat dibuat lubang dengan pencadang logam kemudian dipipet 0,1 ml larutan uji ekstrak etanol dari biji pepaya coklat dengan berbagai konsentrasi, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37±1oC selama 18–24 jam, lalu diukur diameter daerah hambatan (zona jernih) pertumbuhan di sekitar lubang dengan menggunakan jangka sorong.
