II.3 DNA Polimerase
II.3.2 Struktur dan Fungsi DNA Polimerase
Fragmen Klenow (KF) Pol I E.coli merupakan struktur kristal DNA Pol yang pertama kali ditentukan (Ollis dkk., 1985) dan setelah itu struktur DNA Pol lainnya telah berhasil ditentukan seperti DNA Pol I Taq (Eom dkk., 1996), T7 DNA Pol (Sousa dkk., 1993), RB69 DNA Pol B (Wang dkk., 1997), DNA Pol dari spesies Thermococcus (Hopfner dkk., 1999; Rodriguez dkk., 2000), DNA Pol dari hipertermofil arkhea (Hashimoto dkk., 2001). Hingga saat ini, koleksi struktur kristal DNA Pol yang tersimpan di PDB telah mencapai 274 buah kristal. Secara umum, selain memiliki aktifitas polimerisasi yang terdapat pada domain polimerase, enzim ini juga memiliki aktivitas lain seperti perbaikan DNA dan pelepasan primer Okazaki yang biasanya terdapat pada domain berbeda. Keseluruhan studi struktur kristal ditunjang dengan analisis biokimia menunjukkan bahwa DNA Pol selain memiliki domain polimerase 5’3’, juga
memiliki domain eksonuklease 3’5’ dan atau eksonuklease 5’3’. Jika kedua
aktivitas ini dimiliki, maka domain eksonuklease 5’3’ akan terdapat pada
daerah ujung-N (N-terminal), domain polimerase 5’3’ akan terdapat pada
daerah ujung-C (C-terminal), sedangkan domain eksonuklease 3’5’ akan
terletak di antaranya sehingga disebut sebagai domain penghubung (intervening) (Joyce dan Steitz, 1994). Gambar II.14 menunjukkan struktur kristal Taq Pol I dengan ketiga domain yang dimilikinya dalam dua orientasi posisi domain eksonuklease 5’3’ (Kim dkk., 1995; Urs dkk., 1999). Beberapa Pol lainnya
memiliki domain tertentu yang dibutuhkan untuk berinteraksi dengan sub unit lain, seperti Pol α eukarya yang juga memiliki sub domain zinc finger untuk berinteraksi dengan kompleks polimerase-primase (Albà, 2001).
Gambar II.14.Struktur Kristal 3D dari Taq Pol I. Enzim ini merupakan enzim multifungsi dan multidomain yang terdiri atas : domain eksonuklease 5’3`, domain eksonuklease 3’5’ dan domain
polimerase 5’3’. Pada domain polimerase terdapat tiga
subdomain yaitu: ibu jari (thumb), jemari (fingers), dan telapak (palm). Visualisasi dilakukan dengan perangkat lunak VMD terhadap 1TAQ (Kim dkk., 1995) dan 1CMW (Urs dkk., 1999). α -helix digambarkan dalam bentuk -helix berwarna ungu dan β-sheet dalam bentuk anak panah berwarna kuning.
II.3.2.1 Aktivitas dan Domain Eksonuklease 5’3’
Aktivitas ini sering disebut juga sebagai 5’nuklease dan diperlukan untuk proses translasi celah (nick translation) yaitu terputusnya ikatan fosfodiester pada salah satu untai DNA yang menyebabkan kerusakan DNA, maupun proses pendegradasian RNA primer pada fragmen Okazaki (Kaiser dkk., 1999). Penjajaran urutan asam amino pada daerah eksonuklease 5’3’ dari beberapa
kelas polimerase eubakteri dan bakteriofaga, serta komparasi data struktur domain ini dari T5 (Ceska dan Sayers, 1998), Taq Pol I (Kim dkk., 1995) dan T4 RNase H (Mueser dkk., 1996), menunjukkan adanya enam motif lestari yaitu motif A, B, C, D, E dan F (Joyce dkk., 1982; Perler dkk., 1995) sebagaimana terangkum pada Tabel II.5 Sisi aktif domain ini terdiri atas sejumlah residu karboksilat yang diduga berperan dalam pembentukan ikatan koordinasi dengan ion logam untuk
menjalankan aktivitasnya. Sedangkan untuk kelas eukarya dan arkhea, aktivitas 5’nuklease disebut dengan flap endonuklease (FEN1) karena kesamaan struktur dan aktivitas, namun berbeda urutan asam aminonya (Turchi dkk., 1994; Bambara dkk., 1997).
Tabel II.5. Motif lestari yang terdapat pada domain eksonuklease 5’3’
(Perler dkk., 1996).
Motif Urutan asam amino
A B C D E F leu ile phe GLU ile leu LEU val ARG ala ile Xaa leu leu Xaa ASP ser GLY val Xaa GLU ASP Xaa ASP ASP PHE Xaa5 val ASP Xaa2 GLY Xaa TYR Xaa lys ser ASP LYS ala ASP ASP Xaa2 Xaa asn ARG leu
Asam amino yang ditulis dengan huruf kapital merupakan asam amino yang selalu ada pada posisi tersebut; asam amino yang dimulai dengan huruf kecil merupakan asam amino yang umum dijumpai pada posisi tersebut. Xaa menunjukkan asam amino lain atau tidak ada asam amino
II.3.2.2 Aktivitas dan Domain Eksonuklease 3’5’
Pada umumnya, domain ini terdapat pada rantai polipeptida yang sama dengan domain polimerase tetapi dengan aktivitas yang saling berlawanan dimana aktivitas eksonuklease 3’5’ ini dibutuhkan untuk pembacaan kesalahan
(proofreading) ketika reaksi polimerisasi berlangsung (Kroutil dkk., 1996). Namun pada beberapa keluarga Pol, misalnya Pol C E.coli, aktivitas eksonuklease ini terdapat pada sub unit terpisah dari enzim inti (core enzyme) (Perler dkk., 1996). Data struktural menunjukkan bahwa jika domain ini terdapat pada polipeptida yang sama dengan polimerase, maka sisi aktif kedua domain terpisah sekitar 3 Å (Ollis dkk., 1985; Freemont dkk., 1988), mengindikasikan bahwa ketika polimerisasi berlangsung terdapat 2 jenis pengikatan terhadap DNA cetakan-primer (Gambar II.15) tergantung apakah enzim sedang melakukan pemasangan atau pengeditan nukelotida (Joyce dan Steitz, 1994; Steitz, 1999).
Kombinasi hasil penjajaran urutan asam amino, data struktural dan mutagenesis terhadap sejumlah DNA Pol menunjukkan adanya tiga motif lestari (Tabel II.6) yaitu motif ExoI, ExoII dan ExoIII. Adapun mekanisme reaksi eksonuklease 3’5’ diduga dipengaruhi oleh pembentukan ikatan koordinasi dengan dua ion
logam. Studi terhadap KF menunjukkan bahwa mutasi pada residu aspartat (Asp355, Asp424, Asp501) menyebabkan penurunan afinitas terhadap ion logam dan secara langsung menurunkan aktifitas eksonuklease 3’5’ (Beese dan Steitz,
1991; Kroutil dkk., 1996).
Gambar II.15.Model yang diajukan untuk proses polimerisasi maupun pengeditan pada DNA Pol. Sisi aktif eksonuklese 3’5’ akan
mengikat DNA untai tunggal sedangkan sisi aktif polimerase akan mengikat DNA untai ganda (Joyce dan Steitz, 1994; Steitz, 1999).
Tabel II.6. Motif lestari yang terdapat pada domain eksonuklease 3’5’
(Perler dkk., 1996)
Xaa menunjukkan asam amino yang lain atau tidak ada
Motif Urutan asam amino
ExoI ExoII ExoIII
Asp Xaa Glu
Asn Xaa2-3 (Phe/Tyr)Asp Tyr Xaa3 Asp
II.3.2.3 Aktivitas dan Domain Polimerase 5’3’
Komparasi struktur 3D DNA Pol yang telah ditentukan menunjukkan bahwa domain polimerase memiliki morfologi seperti tangan kanan, terdiri atas tiga subdomain yaitu jemari (fingers), ibu jari (thumb) dan telapak (palm) serta terletak pada daerah ujung-C enzim (Joyce dan Steitz, 1994). Subdomain jemari tersusun atas struktur α-helix dan memiliki peranan untuk mengikat nukleotida serta mengorientasikan DNA cetakan untai tunggal agar bersilangan dengan ujung primer. Kombinasi data struktural dan studi mutagenesis menyarankan bahwa residu Arg754, Lys758 dan Phe762 yang terdapat pada subdomain jemari pada KF berperan penting dalam pengikatan dNTP (Joyce, 1997; Astatke dkk., 1998). Secara umum pada subdomain ini terdapat 2 jenis struktur sekunder protein : keseluruhan α-helix seperti pada KF (Ollis dkk., 1985), Taq Pol I (Kim dkk., 1995), RB69 dan campuran struktur α-helix dan β-sheet yang dijumpai pada keluarga Pol yang menggunakan RNA sebagai cetakan seperti Reverse Transkriptase.
Subdomain ibu jari pada umumnya terdiri atas dua untai antiparalel α-helix dimana setiap α-helix tersebut berinteraksi dengan lekuk minor (minor groove) dari produk templat-primer. Subdomain ini berperan dalam memposisikan untai ganda DNA, mengikat lekuk minor poduk DNA yang dihasilkan serta menentukan prosesivitas enzim (ukuran sejumlah nukleotida yang ditambahkan oleh DNA Pol sebelum enzim tersebut terdisosiasi dari substratnya) (Joyce dan Steitz, 1994; Kelman dkk., 1998). Sedangkan pada subdomain telapak yang berbentuk beberapa β-sheet anti-paralel, terdapat sisi katalitik enzim, sisi pengikatan terhadap ujung 3’ primer serta sisi lain yang berkontribusi terhadap pengikatan dNTP (Patel dkk., 2001).
Keseluruhan DNA polimerase mengkatalisis reaksi polimerisasi yang sama yaitu menambahkan dNTP pada ujung 3’ primer, diringkaskan sebagai berikut :
Di dalam sel, reaksi di atas bersifat irreversible karena kehadiran pirofosfatase anorganik yang akan menghidrolisis pirofosat yang dihasilkan pada proses di atas. Reaksi polimerisasi melibatkan serangkaian tahapan meliputi pengikatan primer-DNA cetakan, pengikatan dNTP, perubahan konformasi, tahap reaksi kimia, perubahan konformasi tahap kedua, pelepasan pirofosfat, pelepasan primer dari DNA cetakan ataupun terjadinya pengulangan tahapan polimerisasi (Perler dkk., 1996). Hasil studi struktur fungsi Pol yang ada (Joyce dan Steitz, 1994; Joyce dan Steitz, 1995; Steitz, 1999) mengindikasikan bahwa reaksi transfer fosforil dikatalisis oleh dua ion logam. Ion logam 1 berinteraksi dengan ujung 3’ OH dari primer sedangkan ion logam 2 memfasilitasi lepasnya gugus β- dan γ-fosfat menghasilkan pirofosfat. Kedua ion logam ini juga diduga berperan dalam menstabilkan struktur dan muatan keadaan transisi pentakovalen yang terjadi pada setiap tahap reaksi polimerisasi (Gambar II.16). Dalam keluarga Pol I dan Pol X, Mg2+ merupakan ion logam yang umum terikat pada residu asam karboksilat lestari yang hanya terpisah pada jarak 4 Å (Joyce dan Steitz, 1995).
Gambar II.16.Mekanisme reaksi polimerisasi yang dimediasi oleh dua ion logam divalent. Kedua ion logam (Mg2+) akan terikat pada enzim melalui residu asam karboksilat lestari. (Joyce dan Steitz, 1994; Joyce dan Steitz, 1995).