BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.3 Progress Penelitian Kultur Embryo Kelapa 2.3.1 Tahap Germinasi Embrio kelapa yang akan di tanam dalam media kultur di ambil dari buah yang berumur 10-11 bulan. Tahap koleksi embrio dari lapang terdiri atas tahap pemanenan buah kelapa sebagai sumber embryo, pengupasan dan pengambilan silinder endosperma, pemisahan embryo dari endosperma. Pengambilan silinder endosperma dilakukan dengan menggunakan pipa besi dengan diameter 1,6 cm pada mata aktif. Tahap selanjutnya merupakan tahap yang paling penting dalam kultur jaringan yaitu tahap teknik aseptic yang terdiri dari persiapan embrio steril dan pemeliharaan embrio secara in vitro. Embrio kelapa disterilkan dengan menggunakan 3 % larutan natrium hipoklorit selama 5 menit lalu dicuci selama beberapa saat dengan menggunakan akuad.Tingkat keberhasilan kultur embryo kelapa sampai saat ini masih bervariasi tergantung kepada kondisi laboratorium masing-masing pusat penelitian maupun pengalaman dan kemampuan tenaga peneliti dalam mengaplikasikan teknik in vitro (Engelmann 2005). Tingkat keberhasilan kultur embryo kelapa bervariasi antara 15 – 88 % (Karun et al. 2002; Mashud 2002; Rillo et al. 2002; Weerakoon et al. 2002). Aplikasi kultur embrio untuk menghasilkan bibit kelapa telah banyak dilakukan di beberapa negara seperti Sri Lanka, Perancis, Filipina, India termasuk Indonesia. Namun, tingkat keberhasilan kultur embryo di setiap negara bervariasi, sedangkan aplikasi pada kelapa kopyor memberikan hasil yang lebih rendah dibandingkan dengan kelapa normal. Pada tahap ini, tingkat keberhasilan germinasi embryo kelapa kopyor di Indonesian Coconut and Other Palm Research Institute (ICOPRI), Manado adalah 63 % (Mashud and Manaroinsong 2007), sedangkan di Universitas Pembangunan Nasional (UPN) Surabaya sebesar 47 % (Sukendah et al. 2008). Di Universitas Muhammadiyah Purwokerto, hasil germinasi embryo kelapa kopyor tipe genjah asal Purbalingga Jawa Tengah juga menunjukkan tingkat keberhasilan yang hampir sama, yaitu 55 % (Sriyanti 2010). 2.3.2 Tahap Aklimatiasi Aklimatisasi adalah tahapan untuk memindahkan plantlet atau bibit tanaman yang dihasilkan dari kultur jaringan dari lingkungan in vitro ke lingkungan ex vitro (George and Debergh 2008). Tahapan ini merupakan tahap paling penting dari kultur embryo karena sangat memungkinkan menyebabkan kegagalan dan matinya bibit yang dihasilkan. Plantlet yang dihasilkan dari kultur jaringan umumnya tumbuh dalam tabung yang tertutup rapat guna menghindari kontaminasi, namun kondisi ini mengakibatkan kelembapan udara di dalam tabung jauh lebih tinggi dibandingkan kondisi di luar tabung sehingga mengakibatkan pertukaran gas CO2 dengan lingkungan luar menjadi sangat terbatas (Paspisilova et al. 1999). Disamping itu, media tanam umumnya diberi tambahan gula sebagai sumber karbon dan energi serta intensitas cahaya yang relatif rendah. Ketiga hal tersebut mengakibatkan plantlets yang dihasilkan menjadi abnormal baik secara morfologi maupun fisiologi sehingga menyebabkan kegagalan dalam produksi bibit menggunakan teknik kultur jaringan (Afreen et al. 2002; Franco et al. 2007; George and Debergh 2008; Paspisilova et al. 1999; Preece and West 2006). Pada kultur embryo kelapa tingkat kegagalan pada tahap aklimatisasi masih relatif tinggi, berkisar 60 sampai 90 % (Engelmann and Batugal 2002; Karun et al. 2002). Kegagalan pada kultur embryo kelapa kopyor juga sangat tinggi, yaitu mencapai 80 % (Mashud and Manaroinsong 2007). Beberapa upaya telah dilakukan untuk memperbaiki protokol kultur embryo guna meningkatkan kesintasan tanaman pada tahap aklimatisasi seperti menginduksi peningkatan jumlah akar primer dan sekunder dengan menambahkan zat pengatur tumbuh auksin ke dalam media tanam (Lien 2002; Rillo et al. 2002), perbaikan teknik aklimatisasi dengan menggunakan kotak plastik (Magdalita et al. 2010), maupun pemberian gas CO2 ke dalam kotak aklimatisasi guna meningkatkan laju fotosintesis tanaman yang diaklimatisasi (Samosir et al. 2008). Perlakuan-perlakuan tersebut dan beberapa perlakuan lain yang umum digunakan untuk meningkatkan keberhasilan aklimatisasi seperti pengaruh cahaya, kelembapan, udara, suhu maupun substrat tanam (Afreen 2005), belum pernah diaplikasikan pada kultur embryo kelapa kopyor sehingga dalam penelitian ini akan dilakukan upaya meningkatkan kesintasan bibit kelapa kopyor pada tahap aklimatisasi 2.4 Embryo Splitting serta Kemungkinan Aplikasinya pada Kelapa Kopyor Aplikasi teknik embryo yang dibelah (embryo splitting) pada perbanyakan kelapa kopyor memiliki tingkat germinasi yang masih rendah, yaitu kurang dari 60 % (Sukendah 2009). Beberapa cara dapat dilakukan untuk meningkatkan germinasi embryo kelapa seperti seleksi teknik pembelahan embryo, seleksi medium dasar dan penambahan zat pengatur tumbuh ke dalam medium tanam. 2.4.1 Seleksi Teknik Pembelahan. Terdapat satu teknik pembelahan yang telah dilaporkan oleh Sukendah (2009) yaitu embryo dibelah menjadi dua kemudian ditanam pada medium germinasi. Kelemahan yang diperoleh dari teknik ini adalah hanya dua eksplan yang ditanam disamping memerlukan media yang lebih banyak. Teknik lain yang lebih efisien yang perlu dicobakan adalah dengan membelah embryo secara bertahap, yaitu dengan menoreh embryo sampai seperempat dan menoreh embryo sampai setengahnya. Embryo ditoreh menjadi dua, empat maupun delapan bagian. 2.4.2 Seleksi Medium Tanam. Media yang umum digunakan dalam kultur embryo dan embryo splitting adalah ”Hybrid Embryo Culture (HEC)” (Rillo, 2004), Y3 (Eeuwens 1976) maupun medium ”Coconut Research Institute” (Y3CRI) (Weerakoon et al. 2002). Media HEC memiliki kelebihan komposisi dibandingkan dua media yang lain, yaitu dalam hal vitamin (folic acid, biotin dan glycine). Senyawa-senyawa tersebut juga telah dilaporkan mampu meningkatkan perkecambahan kelapa seperti telah dilaporkan pada penelitian. 2.4.3 Seleksi Zat Pengatur Tumbuh Beberapa zat pengatur tumbuh telah dicobakan untuk meningkatkan germinasi embryo kelapa normal seperti asam gibberellat (GA3; (Karun et al. 2002; Mashud 2002; Pech y Ake et al. 2007; Pech y Ake et al. 2002; Weerakoon et al. 2002), asam absisat (ABA, (Damasco 2002; Karun et al. 2002; Mashud 2002; Weerakoon et al. 2002), benziladenina (BAP, (Rillo et al. 2002)) dan asam naftalen asetat (NAA, (Rillo et al. 2002). Beberapa zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media tanam dilaporkan mampu meningkatkan germinasi embryo kelapa, seperti GA3 (Mashud 2002; Pech y Ake et al. 2007; Pech y Ake et al. 2002; Weerakoon et al. 2002) dan ABA (Karun et al. 2002). Namun, zat pengatur tumbuh yang lain tidak mampu meningkatkan germinasi embryo kelapa seperti NAA, BAP (Rillo et al. 2002) dan ABA (Damasco 2002). Pada kultur embryo kelapa kopyor, penambahan GA3 ke dalam medium telah diujikan namun hasilnya menunjukkan bahwa perlakuan tersebut tidak mampu meningkatkan germinasi embryo kelapa kopyor. Pemberian GA3 dengan durasi yang berbeda maupun penambahan zat pengatur tumbuh yang lain ke dalam media tanam belum pernah dilaporkan dan akan diujikan dalam penelitian ini. BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 3.1 Tujuan Sampai saat ini, protokol embryo splitting belum tersedia sehingga belum dapat diaplikasikan untuk penyediaan bibit kelapa kopyor secara masal, sehingga tujuan utama penelitian ini adalah untuk mengembangkan protokol embryo splitting dan mengaplikasikannya dalam produksi bibit kelapa kopyor. Adapun tujuan penelitian ini adalah : 1. Menguji dua teknik pembelahan embryo zygotik guna memperoleh teknik pembelahan yang optimal. 2. Melakukan seleksi dua medium dasar yang paling baik untuk mengecambahkan embryo yang dibelah, 3. Melakukan seleksi konsentrasi zat pengatur tumbuh yang paling optimum untuk mengecambahkan embryo yang dibelah. 3.2 Manfaat Penelitian Penelitian tentang pengembangan protokol embryo splitting untuk penyediaan bibit kelapa kopyor sangat penting dilakukan mengingat tingginya nilai ekonomi kelapa kopyor dan belum tersedianya protokol yang memadai. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan luaran jangka pendek dan jangka panjang yang penting dalam pengembangan ipteks, menunjang pembangunan nasional khususnya berdampak ekonomi dan sosial, serta berperan penting dalam pengembangan institusi khususnya Laboratorium Genetika dan Botani (LGB), Program Studi Pendidikan Biologi, maupun bagi Universitas Muhammadiyah Purwokerto pada umumnya. Pengembangan Ipteks. Penelitian ini diharapkan memberikan dampak jangka pendek berupa protokol embryo splitting dengan tingkat keberhasilan yang lebih tinggi dibandingkan dengan protokol sebelumnya (Mashud 2010; Sukendah 2009). Disamping itu dari penelitian ini juga diharapkan dapat dihasilkan data tentang keragaman morfologi, sitologi, biokimia dan molekuler dari bibit yang dihasilkan dari teknik tersebut sehingga layak untuk dipublikasikan. Target minimal yang ingin dicapai adalah satu artikel di jurnal internasional dapat dipublikasikan dari penelitian ini dan satu artikel yang dipublikasikan di jurnal nasional terakreditasi setelah kegiatan penelitian ini berakhir. Luaran jangka panjang yang diharapkan dapat dihasilkan dari penelitian ini adalah dengan dihasilkannya bibit kelapa kopyor true to type maka dalam jangka waktu yang tidak terlalu lama (1 sampai 3 tahun setelah penelitian ini berakhir), bibit dapat ditanam di lapang untuk kemudian dijadikan kebun plasma nutfah kelapa kopyor pertama di Indonesia. Diharapkan dapat ditanam dua type kelapa kopyor, yaitu dalam dan genjah, sehingga dalam jangka panjang (10 – 15 tahun) akan dapat dihasilkan kelapa hibrida kopyor yang unggul. Kebun plasma nutfah ini akan menjadi pusat penelitian kelapa kopyor pertama di Indonesia dan bahkan dunia. Sifat kelapa kopyor dengan endoserm yang lembut memungkinkan peneliti tanaman lain khususnya tanaman berbiji untuk mengaplikasikan gen yang terdapat pada kelapa kopyor ke tanaman lain sehingga diperoleh tanaman pangan dengan tekstur yang lebih lembut dibandingkan dengan tekstur tanaman pangan yang tersedia saat ini. Menunjang Pembangunan Nasional. Dampak jangka pendek yang diperoleh dari penelitian ini adalah dihasilkannya bibit kelapa kopyor yang memiliki nilai ekonomi sangat tinggi, Harga bibit mencapai hampir 500 ribu rupiah per bibit (Mashud and Manaroinsong 2007). Namun penelitian ini lebih mementingkan pencapaian jangka panjang, berupa pembangunan kebun plasma nutfah kelapa kopyor. Selanjutnya dengan dihasilkan kelapa kopyor hibrida unggul akan sangat menunjang pendapatan petani kelapa di Indonesia. Seperti diketahui petani kelapa di Indonesia mencapai lebih dari 3 juta orang dan merupakan petani miskin (Mahmud and Ferry 2005). Dengan menanam kelapa kopyor hibrida unggul tersebut diharapkan petani akan meningkat pendapatannya seiring dengan tingginya harga kelapa kopyor (Novarianto et al. 2005). Tersedianya produk kelapa kopyor selanjurnya dalam jangka panjang diharapkan akan memacu tumbuhnya industri pangan kelapa kopyor dan memacu eksport buah kelapa kopyor seperti yang terjadi pada saat ini di Philippina dengan kelapa makapuno. Pengembangan Institusi. Kelapa kopyor telah menjadi topik penelitian utama di Laboratorium Genetika dan Botani, Universitas Muhammadiyah Purwokerto dalam tiga tahun terakhir. Penelitian melibatkan mahasiswa tahap akhir yang menggunakan topik tentang kelapa kopyor sebagai bahan skripsi mereka. Sampai saat ini proyek penelitian kelapa kopyor telah meluluskan dua orang mahasiswa, sedangkan empat orang mahasiswa yang sedang melakukan penelitian. Sebagian besar biaya penelitian khususnya kelapa kopyor yang digunakan dibiayai oleh peneliti utama secara mandiri. Dengan adanya penelitian hibah bersaing ini, kegiatan penelitian skripsi mahasiswa dapat terbantu dan semakin banyak mahasiswa yang terlibat dalam kegiatan ini. Di tingkat laboratorium, kegiatan penelitian ini akan meningkatkan capacity building. Laboratorium memiliki fasilitas laboratorium kultur jaringan, memiliki spektrofometer guna menunjang penelitian biokimia dan memiliki mikroskup fluoresecent guna menunjang penelitian sitologi. Pemanfaat peralatan yang dimiliki masih tergolong rendah, lebih menitikberatkan dalam kegiatan praktikum. Penelitian dosen yang masih kurang dalam memanfaatkan fasilitas yang ada, sehingga dengan adanya penelitian ini diharapkan akan memicu penelitian-penelitian dosen yang lain di bidang yang sejenis. Di tingkat universitas, kegiatan penelitian dosen khususnya penelitian hibah bersaing masih cukup rendah, rata-rata sekitar 2 judul per tahun. Dengan jumlah dosen yang mencapai lebih dari 300 orang maka jumlah tersebut masih sangat rendah. Dengan adanya penelitian ini diharapkan akan memicu aktivitas penelitian yang lebih banyak lagi. BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Lokasi dan Bahan Penelitian Penelitian optimasi protokol embryo splitting kelapa kopyor dilakukan di Laboratorium Genetika dan Botani (LGB), Universitas Muhammadiyah Purwokerto (UMP) sejak bulan Februari 2013 sampai sekarang. Bahan yang digunakan adalah embryo kelapa kopyor baik type dalam maupun type genjah yang diperoleh dari Kabupaten Purbalingga dan Banyumas. Kelapa kopyor dari Kabupaten Purbalingga dikumpulkan dari para petani kelapa kopyor dari Kecamatan Kejobong untuk kemudian dikirim ke LGB-UMP untuk dilakukan isolasi embryo dan digunakan dalam penelitian ini. 4.2 Isolasi dan Sterilisasi Embryo Kelapa Kopyor Tahap awal sebelum dilakukan optimasi protokol embryo splitting adalah dilakukan isolasi embryo yang dilanjutkan dengan sterilisasi permukaan agar embryo yang ditanam pada media kultur jaringan tidak terkontaminasi bakteri maupun jamur. Teknik yang digunakan dalam isolasi dan sterilisasi embryo kelapa kopyor merupakan hasil terbaik dari penelitian sebelumnya yang didanai dengan penelitian Endeavour Award, Ministry of Education Australia tahun 2010. Isolasi embryo dilakukan dengan cara sebagai berikut : setelah buah kelapa kopyor dikupas dan dibelah, kemudian embryo diisolasi dari bagian tertentu dari endosperm kelapa, yaitu tepat dibagian salah satu dari tiga ‘mata’ dari kelapa. Namun sering kali terjadi embryo sudah tidak ditempat semestinya karena sifat endosperm yang kopyor, sehingga embryo harus dicari di antara endosperm yang hancur. Isolasi dilakukan dengan menggunakan sendok makan dengan cara mengambil embryo dengan mengikutkan sebagian endospermnya. Setelah diisolasi, embryo kemudian dicuci dengan air mengalir dan dicuci dengan cepat menggunakan etanol 95 % untuk menghilangkan lipid yang menempel. Di dalam laminar air flow cabinet (LAF), embryo diisolasi dari endoosperm, kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass steril yang telah diisi dengan larutan natrium hipoklorida (2,6 %) selama 15 menit. Selanjutnya, larutan tersebut dibuang dan diganti dengan aquadest steril sebanyak 4 kali dan embryo siap digunakan untuk percobaan selanjutnya (Gambar 4.1). Gambar 4.1 Tahapan isolasi dan sterilisasi embryo kelapa kopyor (dari kiri ke kanan). 4.3 Optimasi protokol germinasi Optimasi protokol germinasi dilakukan dengan melakukan penelitian dalam 3 topik penelitian, yaitu uji teknik torehan, uji medium dasar dan uji pengaruh zat pengatur tumbuh (Gambar 4.1). Seluruh penelitian diharapkan dapat diselesaikan pada akhir tahun pertama. Uji teknik torehan. Embryo yang telah disterilkan kemudian ditoreh seperti pada Tabel 4.1 dan Gambar 4.2. Tiga teknik torehan akan digunakan dalam penelitian ini, yaitu ditoreh seperempat pada bagian titik tumbuh, ditoreh setengah dan ditoreh seluruhnya (dibelah /splitting). Jumlah torehan yang akan digunakan juga dua macam, ditoreh menjadi dua bagian dan empat bagian. Setiap bagian embryo kemudian di tanam pada medium hybrid embryo culture (HEC, Rillo, 2004). Setiap perlakuan digunakan 30 embryo. Pada tahap inisiasi, media yang digunakan adalah media padat (8 g/l agar) dengan penambahan sukrosa (60 g/l) dan arang aktif (2 g/l). Kultur dipelihara di ruang gelap untuk mempercepat perkecambahan. Setiap 4 minggu, embryo disubkulturkan ke media baru sampai embryo tersebut berkecambah. Setelah berkecambah, embryo dipindahkan ke ruang terang guna pemanjangan. Tahap ini akan memerlukan waktu antara 3 sampai 4 bulan. Tabel 4.1 Teknik torehan yang akan dilakukan dalam penelitian ini Jumlah belah/toreh Teknik Belah (embryo splitting) Teknik toreh (embryo incision) Dua 1 4 Empat 2 5 Gambar 4.2 Teknik embryo belah (atas) dan embryo toreh (bawah) yang digunakan untuk membelah embryo menjadi dua dan empat bagian. Uji pengaruh medium dasar. Dua medium dasar akan diujikan dalam penelitian ini, yaitu medium MS (Murashige dan Skoog, 1962) dan sebagai kontrol digunakan hibrid embryo culture medium (Rillo, 2004). Setiap perlakuan digunakan 30 embryo. Pada perlakuan ini tidak digunakan penambahan zat pengatur tumbuh. Setiap bagian embryo di tanam pada medium perlakuan yang padat dengan pendahan 8 g/L agar, sukrosa (60 g/l) dan arang aktif (2 g/l). Kultur dipelihara di ruang gelap untuk mempercepat perkecambahan. Setiap 4 minggu, embryo disubkulturkan ke media baru sampai embryo tersebut berkecambah. Setelah berkecambah, embryo dipindahkan ke ruang terang guna pemanjangan. Tahap ini akan memerlukan waktu antara 3 sampai 4 bulan. Uji pengaruh zat pengatur tumbuh. tiga macam zat pengatur tumbuh (ZPT) yaitu benzil amino purin (BAP) dan kinetin (KIN) yang dikombinaiskan dengan asam indol butirat (IBA) akan digunakan dalam penelitian ini. Konsentrasi ZPT yang akan digunakan berkisar antara 10-6 – 10-4 M yang akan diaplikasikan secara terpisah maupun dikombinasikan (Tabel 4.2 dan 4.3). Sebanyak 20 embryo kelapa kopyor umur 11 bulan akan diujikan untuk setiap kombinasi zat pengatur tumbuh yang dicobakan. Teknik yang digunakan adalah sebagai berikut : embryo yang diisolasi dari kelapa kopyor kemudian disterilkan dan ditanam ke dalam terbaik hasil uji medium dsar dengan penambahan ZPT. Teknik yang digunakan untuk memelihara kultur dan tahapan subkultur dilakukan dengan cara yang sama dengan medium dasar. Tabel 4.2 Kombinasi dan konsentrasi benzil aminopurin (BAP) dan indole butiric acid (IBA) yang ditambahkan ke dalam medium germinasi BAP (!M) IBA (!M) 0 20 40 60 80 0 1 2 3 4 5 2 6 7 8 9 10 4 11 12 13 14 15 Tabel 4.3 Kombinasi dan konsentrasi kinetin (KIN) dan indole butiric acid (IBA) yang ditambahkan ke dalam medium germinasi Kin (!M) IBA (!M) 0 5 10 15 20 0 1 2 3 4 5 2 6 7 8 9 10 4 11 12 13 14 15 4.4 Uji Histologi Analisis histologi pada embryo kelapa kopyor yang masih utuh dan kecambah yang berhasil diperoleh dair teknik pembelahan dilakukan dengan metode Sass (Sass, 1951). Sampel embryo difiksasi dengan larutan ethanol selama 48 jam kemudian didehidrasi secara bertahap dengan menggunakan 50, 70, 80, 90, 96 dan 100 % ethanol. Setiap tahap dilakukan selama 1 jam. Ethanol kemudian diganti dengan xylol dan dilakukan pengeblokan dengan parafin. Sampel kemudian dipotong dengan mikrotom pada ketebalan 8 - 10 ! M dan diwarnai dengan safranin dan fast green. Slide kemudian diamati dibawah mikroskup Olympus BX 61 (Olympus Imaging America Inc. Center Valley, PA. USA) dan gambar diambil dengan menggunakan kamera Olympus DP72. 4.5 Analisis Data Data penelitian yang diperoleh akan dianalisis secara statistik menggunakan sofware statistik SPSS release 16 for windows. Semua data yang diperoleh dari percobaan pengembangan protokol kultur embryo akan dianalisis dengan menggunakan analisis varian (ANOVA) dan dilanjutkan dengan perbandingan rata-rata menggunakan Fisher’s Least Significant Differences (LSD). Data yang tidak memenuhi distribusi normal akan ditransformasi menggunakan square root trasformation terlebih dahulu sebelum dianalisis. BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Pengaruh Medium Dasar dan Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Keberhasilan Teknik Embryo Belah Hasil uji teknik embryo belah dua secara langsung kemudian setiap sisi belahan dipelihara pada medium dasar menunjukkan bahwa penambahan kinetin ke dalam medium dasar Murashige dan Skoog (MS) berhasil meningkatkan jumlah kecambah yang dihasilkan dari 30 embryo yang ditana. Pada medium MS dengan penambahan 5 !M kinetin yang dikombinasikan dengan 2 !M IBA hanya mampu menghasilkan rata- rata 30 kecambah (100 %), namun dengan meningkatkan konsentrasi kinetin menjadi 10 !M, jumlah kecambah yang dihasilkan meningkat menjadi 38 kecambah (Gambar 5.1). Hal sebaliknya berhasil diamati pada embryo yang dipelihara pada medium khusus kelapa HEC (hybrid enbryo culture). Pada medium tersebut, enam kombinasi yang digunakan tidak berhasil meningkatkan jumlah kecambah yang diperoleh dari 30 embryo yang digunakan dengan jumlah kecambah sekitar 30 buah (Gambar 5.1). Gambar 5.1 Jumlah kecambah yang dihasilkan dari 30 embryo yang dibelah menjadi dua dan ditanam pada medium dasar Murashige & Skoog (MS) dengan penambahan kinetin (Kin) dan asam indole butirat (IBA) dibadingkan dengan embryo yang ditanam pada mediuk hybrid embryo culture (HEC) dengan penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) dengan komposisi dan konsentrasi yang sama Hasil yang berbeda diamati pada embryo yang telah dibelah menjadi dua dan ditanam pada medium tanam dengan penambahan benzylamino purin (BAP) yang dikombinasikan dengan IBA. Pada kedua medium dasar yang digunakan (MS dan HEC), perlakuan kedua ZPT tersebut tidak berpengaruh secara nyata terhadap jumlah kecambah yang dihasilkan dari 30 embryo yang dibelah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan terbeut hanya mampu menghasilkan kecamabah sebanyak 30 atau kurang. Hal ini menunjukkan bahwa hanya satu dari dua embryo yang dibelah tersebut berhasil berkecambah sedangkan sisi sebelahnya tidak mampu diregenerasikan dengan menggunakan medium dengan penambahan BAP dan IBA (Gambar 5.2). Gambar 5.2 Jumlah kecambah yang dihasilkan dari 30 embryo yang dibelah menjadi dua dan ditanam pada medium dasar Murashige & Skoog (MS) dengan penambahan bensilamino purin (BAP) dan asam indole butirat (IBA) dibadingkan dengan embryo yang ditanam pada mediuk hybrid embryo culture (HEC) dengan penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) dengan komposisi dan konsentrasi yang sama 5.2 Pengaruh Medium Dasar dan ZPT Kinetin dan IBA Terhadap Keberhasilan Teknik Embryo Toreh Dua Hasil penelitian sebelumnya (Gambar 5.1 dan 5.2) belum berhasil diperoleh teknik yang mampu menggandakan jumlah kecambah dari embyro yang ditanam. Hal tersebut didgua karena posisi meristem yang belum terlihat sehingga menyulitkan pembelahan embryo, maka dilakukan perbaikan teknik pembelahan dengan cara embryo dikecambahkan terbelih dahulu selama 1 bulan. Setelah embryo berkecambah, embryo kemudian ditoreh menjadi dua bagian. selanjutnya kecambah terbeut dipelihara lebih lanjut selama satu bulan untuk kemudian dibelah menjadi dua bagian. Hasil penelitian (Gambar 5.3) menunjukkan bahwa hampir seluruh embryo yang dibelah dengan menggunakan teknik embryo toreh tersebut berhasil dikecambahakan pada medium dasar MS dengan penambahan 15 !M kinetin dan 2 !M IBA dengan jumlah kecambah yang dihasilkan mencapai 56 kecambah dari 30 embryo yang ditanam. Seluruh kecambah yang dihasilkan berhasil diregenerasikan membentuk kecambah yang lengkap dengan akar dan pucuk (Gambar 5.4) Gambar 5.3 Jumlah kecambah yang dihasilkan dari 30 embryo yang dibelah menjadi dua melalui teknik embnryo toreh dan ditanam pada medium dasar Murashige & Skoog (MS) dengan penambahan kinetin (Kin) dan asam indole butirat (IBA) dibadingkan dengan embryo yang ditanam pada mediuk hybrid embryo culture (HEC) dengan penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) dengan komposisi dan konsentrasi yang sama Gambar 5.4 Kecambah yang berhasil digandakan dari satu buah embryo yang ditanam dan diberi pelakukan dengan embryo toreh. Atas, embryo yang ditreh menjadi dua bagian dan dipelihara selama satu bulan sebelum dibelah. Bawah, hasil perkecambahan setelah 1 bulan pada medium dasar MS dengan penambahan 15 !M kinetin dan 2 !M IBA Hasil pengukuran terhadap panjang pucuk dan jumlah akar yang dihasilkan per pucuk setelah 8 minggu kultur menunjukkan bahwa medium perlakuan dengan penambahan zat pengatur tumbuh kinetin dan IBA dengan konsentrasi yang berbeda-beda meunjukkan pengaruh yang nyata terhadap tinggi pucuk (Gambar 5.5) dan jumlah akar yang dihasilkan per tunas (Gambar 5.6). Panjang pucuk yang dihasilkan bervariasi antara 1-3 cm tergantung dari medium tanam yang digunakan. Medium MS dengan penambahan 10 !M kinetin dan 4 !M IBA berhasil menginduksi kecambah dengan tinggi mencapai hampir 2,5 cm, sedangkan medium HEC dengan penambahan 10 !M kinetin dan 2 !M IBA hanya menghasilkan kecambah dengan panjang pucuk hanya berkisar 1 cm. Namun demikian hasil analisis statistik menunjukkan bahwa medium dasar tidak berpengaruh secara nyata terhadap panjang pucuk yang dihasilkan. Gambar 5.5 Panjang pucuk rata-rata pada kecambah yang ditanam pada medium dasar Dalam dokumen PENGEMBANGAN PROTOKOL EMBRYO SPLITTING GUNA MENDUKUNG PRODUKSI BIBIT KELAPA KOPYOR SECARA IN VITRO - Digital Library Universitas Muhammadiyah Purwokerto (Halaman 15-62)
