METODE PENELITIAN
3.4. Tahap Pelaksanaan Penelitian
Penelitian kedua dirancang dengan tujuan untuk mengetahui ekspresi protein Vim dan GFAP yang berperan penting dalam perkembangan jaringan serebral korteks.
Sehingga dapat dipakai sebagai model untuk mempelajari mekanisme dan peran dari protein dalam perkembangan otak.
Mencit jantan dan mencit betina dipelihara secara terpisah. Setiap mencit dara yang sedang dalam keadaan estrus, berumur 12-13 minggu, dengan berat badan 25-30gr, dikawinkan dengan mencit jantan yang sama umurnya. Penyatuan mencit jantan dan betina dilakukan pada pukul 17.00. Adanya sumbat vagina pada keesokan paginya, yang merupakan tanda telah terjadinya kopulasi dan dinyatakan sebagai hari kebuntingan ke-nol (Rugh, 1968). Lalu mencit betina tersebut ditimbang berat badannya dan dipisahkan dari yang jantan. Kemudian diberi makan dan minum secara ad libitum serta kandang mencit dibersihkan setiap minggu.
Sampel pada penelitian tahap pertama terdiri dari 20 ekor. Kelompok pertama diberi 2-ME secara intraperitoneal dengan dosis 7,5 mmol/kg berat badan, volume penyuntikan 10 ml/kg berat badan. Kelompok kedua adalah kontrol yang hanya diberi aqubides. Pemberian 2-ME dilakukan pada hari kebuntingan 10 dan pengamatan ke-11, 12,13,14,15,16,17,dan ke-18. Induk mencit di korbankan secara dislokasi serviks dan uterus dibedah untuk diambil fetusya. Otak fetus diisolasi kemudian direndam
37
dalam larutan Cell Lytic M Reagent. Untuk proses elektroforesis digunakan larutan buffer, larutan Coomassie brilliant R” 0,05 %, larutan asam asetat glacial 7% , Marker Seeblue protein, Agarose powder, Akuabidest steril, larutan buffer salin phosfate, membran nitrosellose, Stacking gel, Separating gel solution.
Protein otak disolasi menggunakan kit protein buatan sigma. Analisis protein otak dilakukan secara elektroforesis SDS gel poliakrilamida diskontinu dengan metode Laemmli (Ausubel., 1989: dalam Abinawanto, 1993).
Optimasi Anti bodi primer dan sekunder
Anti bodi primer yang dipakai dalam penelitian ini adalah anti bodi vimentin dan gfap (glial fibriler acidic protein). Optimasi dilakukan untuk mengetahui konsentrasi yang tepat, dalam pemakain penelitian. Antibodi vimentin, masing-masing dilarutkan didalam PBS milk 5%, dengan perbandingan 1: 100, 1:200, 1:400.
Sebanyak 5 µl antibodi tersebut, diteteskan pada membran nitroselulosa, sampai kering.
Membran dimasukkan ke dalam kantung plastik yang telah berisi anti bodi sekunder.
Antibodi sekunder yang dipakai pada penelitian ini adalah Ig G rabbit sc 2005 HRP buatan santa cruz, yang sebelumnya diencerkan dulu dengan perbandingan 1:1000.
Inkubasi selama semalam. Pencucian membran dilakukan sebanyak 3x, untuk menghilangkan sisa susu. Setelah pencucian dilakukan pewarnaan membran dengan larutan pewarna. Jika membran berwarna ungu maka menunjukkan kondisi antibodi primer dan sekunder yang dipakai dalam penelitian tersebut dalam keadaan bagus.
Perhitungan Kandungan Total Protein
Penghitungan kandungan total protein diperlukan untuk uji protein dengan western blot, agar kandungan tiap sumur sama. Perhitungan ini dilakukan dengan Smart BCA Kit Cat No 21071 Japan. Kit terdiri dari larutan A, Larutan B dan larutan BSA 2
38
mg/ml. Pembutan larutan standar BSA diperlukan untuk kalibrasi pada alat nanaodrops, sehingga diperoleh grafik lurus. Pembuatan larutan BSA dilakukan dengan menambah larutan stok BSA dan aquades, dengan konsentrasi semakin meningkat.
Langkah selanjutnya sebelum mengukur kandungan protein adalah membuat larutan WS (working solution). Cara pembuatan larutan ini adalah dengan menambah larutan A dan larutan B dengan perbandingan 50:1. Pengukuran sampel protein dilakukan dengan menambah masing-masing 5 µl protein sampel dan protein BSA ke dalam masing-masing tabung, yang telah berisi larutan working solution. Larutan di campur dengan alat shaker selama 30 detik. Diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37ºC di dalam waterbath. Pendinginan dilakukan selama 10 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan alat nanodrops.
Preparasi gel poliakrilamid
Gel poliakrilamid terdiri atas “separating gel” 10 % dan “Stacking gel”.
“Separating gel” 10 % terbuat dari larutam akrilamida 30 % / bisakrilamida 0,8%
sebanyak 6,7 ml, Tris buffer HCl pH 8,9 3M sebanyak 2,5 ml dan akuades sebanyak 8,5 ml, SDS 20% 0,1 ml, Temed 0,5% sebanyak 2 ml, dan terakhir dimasukkan larutan
39
ammonium-persulfat 10 % sebanyak 0,2 ml. Larutan diaduk merata dan segera
dituangkan ke dalam lempengan kaca pencetak gel sampai terjadi polimerisasi. Setelah larutan “separating gel” terpolimerisasi menjadi “separating gel”, lalu dituangkan larutan “stacking”gel”.
Pembuatan “stacking gel” dilakukan dengan mencampurkan larutan akrilamid 40% bis akrilamid 1,5% bisakrilamid sebanyak 1,2 ml; larutan Tris buffer HCl pH 6,8 sebanyak 2,5 ml dan akuades sebanyak 5,15 ml; 20% SDS 0,05 ml; 0,5% TEMED 1 ml, lalu terakhir dimasukkan larutan ammonium-persulfat 10% sebanyak 0,1ml.
Sebelum terpolimerisasi, ke dalam larutan “stacking gel” dimasukkan sisir. Jarak antara ujung sisir dengan permukaan “separating gel” kurang lebih 1 cm. Jika sudah terjadi polimerisasi, maka sisir dikeluarkan dan terbentuklah sumur-sumur pada gel.
Persiapan sampel protein
Protein yang telah diisolasi dengan larutan cell lytic M reagent dan telah dihitung kandungan proteinnya, ditambahkan larutan buffer sampel dan sisanya agar volume tiap sumur sama maka ditambahkan dengan aquades. Sebelum penambahan larutan tersebut, maka dilakukan penghitungan konsentrasi semua sampel protein, agar setiap sumur mempunyai konsentrasi yang sama. Larutan buffer sampel terdiri dari 2mercaptoethanol ditambah loading buffer. Campuran protein dipanaskan di dalam water bath pada suhu 99ºC selama 5 menit.
Proses elektroforesis
Kedalam sumur pertama, mula-mula dimasukkan larutan marker protein, buatan APRO SP-2120 Lot No A8F04040, sebanyak sebanyak 5 mikroliter. Pada setiap sumur berikutnya dimasukkan 30 µl sampel protein. Larutan buffer elektroda pH 8,3 diisikan ke dalam ruang atas dan di bawah gel masing-masing sebanyak 300 ml, sampai alat
40
tersebut terendam. Untuk menghilangkan gelembung udara digunakan jarum suntik.
Kemudian alat elektroforesis dihubungkan dengan “power supply” yang besar tegangannya 14 mA selama 1 jam. Proses elektroforesis dilakukan sampai “tracking dye” mencapai bagian dasar “separating gel”. Gel hasil elektroforsis dikeluarkan dari alat tersebut secara hati-hati dan siap ditransfer ke membran nitroselulose.
alat elektroforesis Alat semidry blot Western Blot
Untuk mentransfer gel pada kertas atau membran nitroselulosa, maka membran yang diperlukan harus direndam terlebih dahulu di dalam larutan towbin. Ukuran kertas membran untuk transfer disesuaikan dengan ukuran dari gel yag diperoleh. Letakkan masing-masing membran dengan urutan sebagai berikut, di atas mesim semi dry blot.
Hubungkan mesin dengan power suplay 36 mA. Ukuran arus listrik tergantung pada ukuran membran gel yang akan ditransfer. Setiap ukuran 1 cm mendapat arus listrik 0,8 mA. Transfer dilakukan selama 1 jam. Setelah gel tertransfer pada membran nitroselulos, maka membran direndam dalam larutan skim 5% PBS 1x,
_________________
41
selama 30 menit atau diinkubasi selama semalam. Inkubasi selanjutnya dilakukan di dalam larutan antibodi primer yaitu anti Vimentin dengan perbandingan 1: 200 selama semalam. Penambahan antibodi sekunder yaitu anti Ig G rabbit dilakukan setelah pencucian dengan PBST 20x 0,05 % sebanyak 3 kali. Inkubasi di dalam larutan antibodi sekunder dengan perbandingan 1:1000 dilakukan selama 3 jam, kemudian dicuci kembali dengan larutan PBST 20x 0,05% sebayak 2 kali.
Deteksi Membran dengan Fujifilm FLA 9000
Untuk mendeteksi membran menggunakan kit RPN 2109 Cat 394930, yang terdiri dari larutan A dan larutan B. Untuk setiap ukuran 1 Cm2 memerlukan larutan campuran sebanyak 0,125 ml. Pembuatan larutan campuran (larutan A: larutan B) dilakukan dengan perbandingan 1:1. Larutan campuran, diteteskan di atas membran nitroselulosa, diamkan selama beberapa menit. Pentetesan dilakuakn di dalam ruang gelap. Membran dibungkus dengan plastik, yang sebelumnya membran dikeringkan terlebih dahulu. Membran yang sudah dibungkus dengan plastik siap di baca dengan mesin fujifilm FLA 9000.
Fujifil FLA 9000 Kit RPN 2109 Cat 394930
42 Pewarnaan protein
Pewarnaa protein dilakukan, bila membran tidak terdeteksi dengan mesin karena jumlah protein terlalu sedikit. Dengan melakukan elektroforesis ulang, membran gel tidak ditransfer tetapi diwarnai dengan larutan “Coomassie brilliant R” 0,05 % selama kira-kira 12 jam. Proses destaining yaitu proses penghilangan warna latar belakang pada gel selama dua jam dengan memakai larutan destaining selama beberapa kali sampai pita gel terlihat.Setelah warna latar belakang jernih maka akan terlihat pita-pita protein. Gel dapat disimpan sementara dalam larutan asam asetat glacial 7% . Agar dapat disimpan secara permanen, gel dikeringkan di atas kertas saring Whatman 3 mm dan kertas selofan dengan memakai alat pengering gel. Hasil elektroforesis yang diamati adalah pita-pita yang terbentuk, yaitu tebal tipisnya pita dan jumlah pita. Selain itu dari masing-masing pita dihitung nilai mobilitas proteinnya dan harga berat molekulnya.