3. METODE PENELITIAN
3.3 Tahap Penelitian
Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel keong di Perairan Desa Gebang, Cirebon, Jawa Barat, kemudian diambil 30 sampel keong untuk dilakukan pengukuran ukuran (panjang, lebar dan tinggi) serta ditimbang bobotnya. Pengukuran rendemen dari keong (cangkang, jeroan dan daging) dilakukan setelah pengukuran ukuran dan bobot keong ipong-ipong, kemudian dilakukan perebusan, pengukusan serta perebusan dengan penambahan garam terhadap daging keong. Uji hedonik dilakukan untuk mengetahui konsentrasi penambahan garam terbaik, kemudian dilakukan analisis kimia meliputi pengujian proksimat (kadar air, abu, protein, dan lemak), analisis abu tak larut asam dan analisis asam lemak serta kolesterol terhadap daging keong segar, setelah
perebusan, setelah pengukusan dan setelah dilakukan perebusan dengan penambahan garam. Diagram langkah-langkah penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Diagram langkah-langkah penelitian. Perhitungan rendemen Identifikasi Perebusan dengan penambahan garam 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 30 menit Uji hedonik
Pengukuran ukuran & bobot
Uji proksimat
Uji asam lemak
Uji kolesterol Perebusan, suhu 100 °C, 30 menit
Pengukusan, suhu 100 °C, 45 menit
Perebusan 30 menit dan penambahan garam konsentrsi terpilih
Keong
Daging segar
Daging rebus konsentrasi 3%
3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel
Keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) diambil di Perairan Desa Gebang, Cirebon, Jawa Barat. Kemudian sebanyak 30 ekor keong ipong-ipong diukur panjang, lebar dan tinggi, setelah itu dihitung rendemen (cangkang, jeroan dan daging).
Perhitungan rendemen adalah sebagai berikut:
Rendemen (%) = Bobot contoh (g)
Bobot total (g) x 100% 3.3.2 Pengolahan
1) Perebusan
Perebusan keong ipong-ipong dilakukan selama 30 menit pada suhu 100 ˚C. Penentuan suhu dan waktu perebusan untuk mendapatkan keong yang matang dilakukan pada penelitian pendahuluan. Setelah 30 menit kemudian keong ditimbang, lalu daging dipisahkan dengan cangkang serta jeroannya dan dimasukkan dalam plastik untuk pengujian proksimat, asam lemak, dan kolesterol. 2) Pengukusan
Keong ipong-ipong dikukus selama 45 menit pada suhu 100 ˚C. Penentuan suhu dan waktu perebusan untuk mendapatkan keong yang matang dilakukan pada penelitian pendahuluan. Setelah 45 menit kemudian keong diangkat dan ditiriskan kemudian ditimbang, lalu daging dipisahkan dengan cangkang serta jeroannya dan dimasukkan dalam plastik untuk pengujian proksimat, asam lemak, dan kolesterol.
3) Perebusan dengan penambahan garam
Keong ipong-ipong direbus dengan penambahan garam sebesar 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, dan 3 % (w/v) dari volume air rebusan selama 30 menit pada suhu 100 ˚C, kemudian dilakukan uji hedonik atau uji kesukaan untuk mendapatkan konsentrasi penambahan garam yang paling disukai oleh panelis. Perlakuan perebusan dengan garam sesuai dengan hasil uji hedonik, yaitu dengan penambahan garam 3% selama 30 menit, lalu keong ditimbang dan daging dipisahkan dengan cangkang serta jeroannya dan dimasukkan dalam plastik dan dilakukan pengujian proksimat, asam lemak, dan kolesterol.
3.3.3 Uji hedonik
Uji hedonik dilakukan oleh 30 orang panelis semi terlatih menggunakan lembar penilaian uji hedonik berdasarkan SNI-01-2346-2006, spesifikasi yang dinilai adalah rasa dengan nilai 1-9 (1= amat sangat tidak suka, 2= sangat tidak suka, 3= tidak suka, 4= agak tidak suka, 5= netral, 6= agak suka, 7= suka, 8= sangat suka, 9= amat sangat suka). Sampel yang diuji adalah daging keong yang telah direbus dengan penambahan garam pada konsentrasi yang berbeda-beda yaitu 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; dan 3%.
3.3.4 Analisis proksimat
1) Analisis kadar air (AOAC 1995)
Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 ˚C selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 30 menit) hingga dingin dan ditimbang hingga beratnya konstan, kemudian cawan dan sampel seberat 5 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dihomogenkan. Cawan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 ˚C selama 6 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan hingga dingin kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar air:
% kadar air = B−C
B−A x 100% Keterangan: A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan dengan sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram) 2) Analisis kadar abu (AOAC 1995)
Cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 105 ˚C, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram yang telah dihomogenkan dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan abu porselen dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 105 ˚C sampai tidak berasap, selanjutnya cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600 ˚C selama 2-3 jam. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih kemudian cawan abu
porselen didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang beratnya.
Perhitungan kadar abu:
% kadar abu = C−A
B−A x 100% Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)
C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (gram)
3) Analisis kadar protein (AOAC 1995)
Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar (crude protein) pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.
(1) Tahap destruksi
Sampel ditimbang seberat 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir tablet kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H2SO4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 ˚C ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening.
(2) Tahap destilasi
Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan dengan aquades (50 ml). Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40 % sebanyak 20 ml.
Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmenyer 125 ml berisi larutan H3BO3 dan 3 tetes indikator (cairan methyl red dan brom cresol green) yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 200 ml destilat yang bercampur dengan H3BO3 dan indikator dalam erlenmenyer.
(3) Tahap titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmenyer berubah warna menjadi pink.
Perhitungan kadar protein:
% Protein = vol HCl x N HCl x 14,01 x 6,25 x FP
mg sampel x 100% FP = Faktor pengenceran
4) Analisis kadar lemak (AOAC 1995)
Sampel seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung sokhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung sokhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi sokhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40 ˚C dengan menggunakan pemanas listrik selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ˚C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3).
Perhitungan kadar lemak:
% Kadar Lemak = W3− W2
W1 x 100 % Keterangan: W1 = Berat sampel (gram)
W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 6. Analisis kadar abu tidak larut asam (SNI 2354.1:2010)
Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCl 10% dan dididihkan selama 5 menit. Larutan tersebut kemudian disaring dengan kertas saring Whatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida (dengan pereaksi AgNO3). Kertas saring kemudian dikeringkan dalam oven. Abu yang telah kering kemudian diabukan kembali dalam tanur dengan menggunakan wadah cawan porselen. Cawan porselen kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga beratnya tetap (BSN 2010). Kadar abu tidak larut asam ditentukan dengan rumus:
% kadar abu tidak larut asam = Berat abu (g)
3.3.5 Analisis asam lemak (AOAC 1999)
Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat kromatografi. Gas chromatography (GC) memiliki prinsip kerja pemisahan antara gas dan lapisan tipis cairan berdasarkan perbedaan jenis bahan (Fardiaz 1989). Hasil analisis akan terekam dalam suatu lembaran yang terhubung dengan rekorder dan ditunjukkan melalui beberapa puncak pada waktu retensi tertentu sesuai dengan karakter masing-masing asam lemak. Sebelum melakukan injeksi metil ester, terlebih dahulu lemak diekstraksi dari bahan lalu melakukan metilasi sehingga terbentuk metil ester dari masing-masing asam lemak yang didapat. a. Tahap ekstraksi
Terlebih dahulu diperoleh asam lemak dengan sokhletasi dan ditimbang sebanyak 0,02 g lemak dalam bentuk minyak.
b. Pembentukan lemak ester (metilasi)
Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turunan dari asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester metil atau alkil yang lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas (Fardiaz 1989).
Metilasi dilakukan dengan merefluks lemak di atas penangas air dengan
pereaksi berturut-turut NaOH-metanol 0,5 N, BF3 dan iso oktan. Sebanyak 0,02 g minyak dari sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
ditambahkan 1 ml NaOH-metanol 0,5 N lalu dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit pada suhu 80°C. Larutan kemudian didinginkan. Sebanyak 2 ml BF3 ditambahkan ke dalam tabung lalu tabung dipanaskan kembali pada waterbath dengan suhu 80°C selama 20 menit dan didinginkan kemudian ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan dikocok lalu ditambahkan 1 ml iso oktan, kemudian dikocok dengan baik. Larutan iso oktan bagian atas larutan dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung reaksi. Sebanyak 1 µl sampel diinjeksi ke dalam gas kromatografi. Asam lemak yang ada di dalam metil ester akan diidentifikasi oleh flame ionization detector (FID) atau detektor ionisasi nyala dan respon yang ada akan tercatat melalui kromatogram (peak).
c. Identifikasi asam lemak
Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksi metil ester pada alat kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut: jenis alat kromatografi gas yang digunakan adalah SupelcoTM 37 component FAME Mix, Gas yang digunakan sebagai fase bergerak adalah nitrogen dengan aliran bertekanan 20 mL/menit dan sebagai gas pembakar adalah hidrogen dengan aliran 30 mL/ menit, kolom yag digunakan adalah kolom kapiler (capillary column)
yang panjangnya 60 m dengan diameter dalam 0,25 mm. Temperatur terprogram yang digunakan adalah suhu 125 °C, kemudian suhu dinaikkan 5 °C permenit hingga suhu akhir 225 °C.
3.3.6 Analisis kolesterol (Metode Lieberman-Buchards)
Analisis kolesterol daging keong ipong-ipong menggunakan metode Lieberman-Buchards. Metode ini merupakan analisis konsentrasi kolesterol secara kimiawi (Cook, 1958). Sebanyak 0,1 g sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse dan ditambahkan 8 ml alkohol : petroleum benzen (3:1) lalu aduk sampai homogen. Pengaduk dibilas dengan 2 ml larutan alkohol : petroleum benzen (2:1) kemudian disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan dituangkan ke dalam gelas piala untuk diuapkan di atas penangas air. Residu yang tersisa dilarutkan dengan menggunakan kloroform sedikit demi sedikit sambil dituangkan dalam tabung berskala sampai volume 5 ml, kemudian ditambahkan 2 ml acetic anhidrid, 0,2 ml H2SO4 pekat kemudian di vortek dan dibiarkan dalam ruang gelap selama 15 menit. Warna yang dihasilkan adalah warna hijau kebiruan yang dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm. Besarnya absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi kolesterol.