BAB IV METODE PENELITIAN
4.5 Tahapan Penelitian
4.5.1 Determinasi Tumbuhan A. indica
Daun A. indica diidentifikasi di Materia Medika, Batu Jawa Timur.
4.5.2 Analisis Kadar Air
Analisis kadar air digunakan untuk mengetahui kadar air yang terkandung pada serbuk simplisia A. indica. Pengukuran kadar air serbuk simplisia menggunkan moisture analyzer. Alat moisture analyzer dinyalakan dan layar menunjukkan tampilan 0,000 gram, kemudian penutup alat dibuka dan sample
pan kosong dimasukkan ke dalam sample pan handler. Penutup alat diturunkan
dan secara otomatis alat akan menara atau menunjukkan tampilan 0,000 pada layar. kemudian sampel dimasukkan ke dalam sample pan sebanyak ± 0,500 gram dan penutup alat diturunkan. Alat akan secara otomatis memulai pengukuran hingga terbaca hasil pengukuran yaitu berupa %MC pada layar. proses pengukuran kadar air dilakukan pengulangan sebanyak tiga kali. Kadar air yang dimiliki simplisia harus dibawa 10% (Menteri Kesehatan RI, 1994).
4.5.3 Pembuatan Ekstrak A. indica
Simplisia daun A.indica kering sebanyak 250 gram diekstrak menggunakan metode ekstraksi maserasi ultrasonik dengan perbandingan pelarut yaitu 1:20 (b:v). Prosedur pembuatan ekstrak yaitu simplisia daun A. indica masing-masing sebanyak 25 gram dilrendam dengan etanol 70% sebanyak 200 mL, 150 mL dan 150 mL. Kemudian simplisia disonikasi selama 2x3 menit di dalam sonikator (Handayani et al., 2016). Selanjutnya disaring menggunakan kertas saring
Wathman no 42. Setelah proses ekstraksi telah selesai, filtrat ekstrak kemudian
pekat. Hasil rendemen ekstrak etanol 70% daun A. indica dihitung dengan rumus sebagai berikut:
4.5.4 Skrining Fitokimia Golongan Flavonoid pada Ekstrak Daun A. indica
Ekstrak etanol 70% daun A. indica diambil 1 mg dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dalam 1-2 mL metanol panas. Setelah itu ditambah logam Mg dan 4-5 tetes HCl pekat. Hasil positif jika terbentuk larutan bewarna merah atau jingga yang terbentuk menunjukkan adanya flavonoid.
4.5.5 Identifikasi Flavonoid dengan KLT
Plat Kromatografi Lapis Tipis yang digunakan adalah silika gel 60 F254dengan eluen yang dipakai yaitu n-butanol : asam asetat : air (9:2:6) (Rohyani, 2007). Pertama-tama eluen dijenuhkan dengan cara meletakkan kertas saring pada chamber yang telah berisi eluen lalu didiamkan selama kurang lebih 15 menit sampai terjadinya elusi pada kertas saring yang dimasukkan. Langkah selanjutnya adalah penotolan bercak dengan cara menotolkan ekstrak etanol yang telah dilarutkan dengan etanol diatas plat KLT sampai terbentuk noda. Plat KLT tersebut dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen yang sudah dijenuhkan dan dikeluarkan setelah terjadi elusi sampai pada batas 0,5 dari ujung plat, lalu diamati noda yang terbentuk. Noda pada plat KLT kemudian disemprot dengan H2SO4 10% dan akan terbentuk noda kuning sebagai tanda hasil positifnya (Sulistijowati, 2001).
4.5.6 Formulasi dan Pembuatan Sediaan 4.5.6.1 Rancangan Formulasi
1. Formulasi Sistem Mikroemulsi Ekstrak A. indica
Masing-masing formuladibuat sebanyak 20 mL dengan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali, kecuali pada blanko. Karakteristik sistem mikroemulsi yang diharapkan memiliki organoleptis yang baik secara fisik, karakteristik pH masuk dalam rentang 4,5-7, memiliki tipe mikroemulsi m/a, mikroemulsi dengan ukuran partikel dengan ukuran 0,1-1,0 µm, dan uji stabilitas sediaan yang stabil.
Tabel 4.1 Formulasi sistem mikroemulsi ekstrak daun A. indica
Keterangan :
F 1 = Konsentrasi ekstrak daun A. indica 5% (dengan replikasi sebanyak 3x) F 2 = Konsentrasi ekstrak daun A. indica 10% (dengan replikasi sebanyak 3x) F 3 = Konsentrasi ekstrak daun A. indica 15% (dengan replikasi sebanyak 3x)
No Bahan Fungsi Konsentrasi Formula (b/v) Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 1 Ekstrak daun
anting-anting Zat aktif 5% 10% 15% -
2 Isopropil miristat Fase minyak 10% 10% 10% 10% 3 Tween 80 Surfaktan 32% 32% 32% 32% 4 Span 80 Surfaktan 2,5% 2,5% 2,5% 2,5% 5 Isopropanol Ko-surfaktan 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 6 Air bebas CO2 hingga (mL) add Pelarut 100% 100% 100% 100%
4.5.6.2 Pembuatan Sediaan
Gambar 4.1 Skema Pembuatan Sediaan Mikroemulsi Ekstrak daun A. indica 4.5.6.3 Pembuatan Mikroemulsi Ekstrak A. indica
a. Pembuatan Mikroemulsi Ekstrak A. indica
Mikroemulsi yang dibuat dalam penelitian ini bertipe mikroemulsi minyak dalam air (M/A). Jumlah surfaktan span 80 dan tween 80 dihitung sesuai HLB butuh. Formulasi mikroemulsi ekstrak etano daun A.indica terdapat pada tabel 4.1. Langkah pembuatan mikroemulsi dimulai dengan menyiapkan bahan-bahan untuk fase air dan fase minyak. Fase air meliputitween 80, ekstrak etanol daun A. indica dan air bebas CO2. Sedangkan untuk fase minyak meliputi isopropil miristat, span
80, dan isopropanol. Selanjutnya fase minyak dicampur dan diaduk menggunakan
Pembuatan mikroemulsi ekstrak daun A. indica F1, F2, F3, dan F4 (masing-masing 3x replikasi)
Tween 80 dan ekstrak A. indica di dispersikan ke dalam air bebas CO2 hingga homogen. ±15 menit dengan kecepatan magnetic stirer 1400 rpm dan suhu 40oC
Span 80 dan isopropil miristat, isopropanol dicampur hingga homogen ±15 menit dengan kecepatan magnetic stirer 1400 rpm
Campuran fase minyak di campur ke dalam fase air, kemudian diaduk ±15 menit dengan kecepatan
magnetic stirer 1400 rpm
Ekstraksi daun pH A.
indica dengan pelarut
etanol 70%
Ekstrak etanol daun A. indica
Skrining fitokimia golongan flavonoid dan identifikasi
dengan KLT
magnetic stirer kecepatan ± 1400 rpm selama 15 menit. Sedangkan untuk fase
minyak diaduk menggunakan magnetic stirer kecepatan ± 1400 rpm selama 15 menit dengan suhu 40oC. Kemudian fase minyak dan fase air dicampur menjadi satu dan diaduk menggunakan magnetic stirer dengan kecepatan ± 1400 rpm selama 15 menitsampai terbentuk mikroemulsi yang jernih.
4.5.7 Evaluasi Sediaan 4.5.7.1 Uji Organoleptis
Pengamatan ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik fisik sediaan yang telah dibuat. Sediaan mikroemulsi diamati secara visual yaitu bentuk, warna, dan bau. Interpretasi hasil dari uji organoleptis yaitu didapatkan mikroemulsi berbentuk cair, jernih dan transparan.
4.5.7.2 Uji pH
Uji pH dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui nilai pH mikroemulsi masuk ke dalam rentang pH yang masih diterima kulita atau tidak. Sebanyak 1 gram sediaan mikroemulsi diukur nilai pH dengan menggunakan pH meter. Kemudiaan nilai pH mikroemulsi disesuaikan dengan pH kulit, yaitu 4,5-6,5 (Tranggono, 2007).
4.5.7.4 Uji Stabilitas Cycling Test
Sampel disimpan pada suhu 4oC selama 48 jam lalu dipindahkan ke dalam oven bersuhu 40±2oC selama 48 jam, waktu penyimpanan dua suhu tersebut dianggap satu siklus. Uji stabilitas dilakukan seebanyak 3 siklus kemudian diamati ada tidaknya pemisahan fase dan inversi (Djajadisastra, 2004).
4.5.7.5 Uji Pemeriksaan Tipe Mikroemulsi
Pemeriksaan tipe emulsi dan mikroemulsi dilakukan dengan menaburkan zat warna larut air, yaitu methylen blue pada permukaan sediaan di atas kaca objek dan diamati di bawah mikroskop optik. Jika sediaan merupakan tipe minyak dalam air maka zat warna methylen blue akan melarut di dalamnya dan berdifusi merah ke seluruh bagian dari air. Jika sediaan merupakan tipe air dalam minyak maka partikel-partikel zat warna metilen methylen blue akan bergerombol pada permukaannya (Martin et al.,1993).
4.5.7.6 Uji Ukuran Partikel
Pengukuran ukuran partikel pada sediaan mikroemulsi dilakukan untuk mengetahui ukuran partikel dari mikroemulsi ekstrak daun A. indica. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat Particle Size Analyzer (PSA) seri zatasizer (Malvern). Alat ini mampu mengukur ukuran partikel dan molekul yang berada dalam rentang 0,15 nm sampai dengan 10 nm denagn sensitivitas alat 3-10.000 nm (Malvern, 2012). Ukuran partikel yang diharapkan yaitu masuk dalam rentang antara 0,1-10 µm (Nikumbh et al., 2013).
4.5.8 Uji Aktivitas Bakteri
4.5.8.1 Penyiapan Alat dan Sterilisasi
Alat dan bahan yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri ini disiapkan dan disterilisasi. Sterilisasi alat dan bahan dengan cara membungkus alat-alat dengan kertas kemudian dimasukkan plastik, kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi (per square inchi) selama 15 menit.
4.5.8.2 Penyiapan Media Nutrient Agar (NA)
Dilarutkan 3,5 gram serbuk media nutrient agar (NA) dalam aquades steril ad 125 mL. Kemudian dipanaskan hingga semua bahan terlarut secara homogen. Selanjutnya campuran tersebut disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121ºC selama 15 menit.
4.5.8.3 Peremajaan Bakteri Uji
Mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri gram positif yaitu bakteri
Staphylococcus aureus. Kultur bakteri disiapkan, diambil 2-3 koloni bakteri,
dimasukan ke dalam tabung reaksi steril yang telah berisi media nutrient agar steril. Setelah memadat tabung reaksi yang berisi bakteri dan media agar diinkubasi selama 24 jam dan dengan suhu 37ºC.
4.5.8.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri Staphylococcus aureus
Pada penelitian ini menggunakan 6 kelompok yaitu sediaan mikroemulsi, kontrol negatif berupa sediaan mikroemulsi tanpa ekstrak daun A. indica, kemudian kontrol positif berupa antibiotik klindamisin 1,2% serta kelompok pembanding yaitu dengan menggunakan air steril.
Metode uji antibakteri yang digunakan pada penilitian ini adalah difusi sumuran. Pertama suspensi bakteri Staphylococcus aureus dicampurkan media
Nutrient agar steril, lalu didiamkan hingga setengah mengeras. Selanjutnya,
dibuat sumur (well) dengan menggunkan bor gabus pada media plate dengan diameter ± 8 mm. Satu cawan petri berisi tiga sumuran dengan jarak sumuran yang telah diatur agar daerah pengamatan tidak saling bertumpuh. Setelah itu dimasukkan sediaan mikroemulsiekstrak daun A. indica (5%, 10% dan 15%),
mikroemulsi tanpa ekstrak (kontrol negatif), klindamisin phosphat 1,2% (kontrol positif) dan air steril (pembanding) pada masing-masing sumur yang telah diberi tanda. Kemudian dimasukkan plate tersebut ke dalam inkubator dan ditunggu selama 24 jam pada suhu 37ºC. Akan nampak area bening di sekitar sumur yang bersih atau tanpa koloni bakteri, yang disebut zona hambat. Dihitung diameter zona hambat.
