BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman jarak cina (Jatropha multifida L.) dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 2. Pembuatan simplisia
Berdasarkan percobaan Sari dan Sari (2011) yang telah dimodifikasi, bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini yang berupa batang, terlebih dahulu dicuci sampai bersih dan diiris tipis-tipis. Batang yang telah diiris tipis –
tipis kemudian dijemur di bawah sinar matahari, dan ditutup dengan kain berwarna hitam. Bahan hasil pengeringan tersebut dihaluskan dengan blender
sampai halus dan diayak. Pengayak yang digunakan memiliki ukuran mesh 40. Jika masih terdapat, serbuk simplisia yang belum lolos ayakan mesh 40, maka dilakukan penghalusan kembali menggunakan blender. Penghalusan kembali
bertujuan agar dihasilkan serbuk yang lebih halus sehingga dapat digunakan pada proses ekstraksi.
3. Ekstraksi dengan maserasi
Proses ekstraksi dilakukan dengan etanol 70 % sebanyak 250 ml untuk 30 gram, selama 2 hari. Hasil maserasi dipisahkan, dan dilanjutkan dengan remaserasi dengan menggunakan 250 ml etanol 70%. Filtrat yang dihasilkan, diuji kandungan taninnya.
4. Uji kualitatif tanin
Sebanyak 3 tetes ekstrak batang jarak cina diambil menggunakan pipet tetes dan dimasukkan ke dalam cawan porselen. Dilakukan penambahan dengan 3 tetes reagen FeCl3. Jika terdapat tanin, maka akan memberikan warna biru kehitaman sampai hijau kehitaman (Maula, 2014).
5. Uji kualitatif antibakteri
a. Pembuatan stok bakteri Staphylococcus aureus
Sebanyak 7,6 gram media Muller Hinton Agar (MHA) disuspensikan dalam 200 ml akuades. Larutan MHA yang telah dibuat kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 5 ml. Media yang telah dibuat kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf suhu 121oC selama 15 menit. Jika
proses sterilisasi selesai, tabung reaksi tersebut disimpan pada kemiringan 30-45o dan dibiarkan hingga media memadat. Sebanyak 1 ose biakan murni
Staphylococcus aureus diambil dan diinokulasikan pada media agar miring secara zig-zag dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu suhu 37oC.
b. Pembuatan suspensi bakteri Staphylococcus aureus
Koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok dengan menggunakan jarum ose dan kemudian dimasukan kedalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,9%. Kekeruhan suspensi bakteri disesuaikan dengan kekeruhan standard Mac Farland 1 (3 x 108 CFU/ml).
c. Pengujian potensi antibakteri ekstrak batang jarak cina
Pada metode ini, strain bakteri Staphylococcus aureus dioleskan pada media MHA yang telah dibuat dengan menggunakan cutton buds dengan arah zig zag. Media MHA yang dibuat kemudian diberi lubang sumuran dan ekstrak batang jarak cina 5%, dimasukkan ke dalam lubang sumuran yang telah dibuat. Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C. Setelah diinkubasi, zona jernih yang dihasilkan, diukur. Untuk kontrol negatif, dilakukan dengan cara yang sama dengan diatas. Namun, pada kontrol negatif menggunakan akuades yang dimasukkan ke dalam lubang sumuran.
6. Formula Krim
Formula krim antibakteri yang dibuat, mengacu pada formula krim antibakteri ekstrak O.corniculata yang dibuat oleh Handali, Hosseini, Ameri, dan Mohimipour (2011). Formula tercantum pada tabel III.
Tabel III. Formula krim acuan
Bahan Jumlah (g) Asam stearat 1 Spermaseti 0,5 Setil alkohol 0,5 Gliserin 0,5 Triethanolamin 0,2 Benzil alkohol 0,2 Akuades 7 O.corniculata extract 0,1 (Handali dkk., 2011). Tabel IV. Formula modifikasi krim ekstrak batang jarak cina
Komposisi
Formula (g)
F1 Fa Fb Fab
Ekstrak batang jarak cina 5 5 5 5
Asam stearat 20 20 20 20 Tween 80 2 4 2 4 BHT 0,02 0,02 0,02 0,02 Propilen glikol 10 10 11 11 Triethanolamine 2 2 2 2 Metil paraben 0,2 0,2 0,2 0,2 Akuades 60 60 60 60
Faktor yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tween 80 dan propilen glikol. Proses penentuan level tinggi dan rendah formula dilakukan dengan tahapan orientasi terlebih dahulu. Penggunaan Tween 80 sebagai emulsifying agent maksimal adalah 10% dan propilen glikol sebagai humektan maksimal adalah 15 %. Tween 80
dipilih dengan range 2, 3, 4, 5, 6 gram, dan pada propilen glikol dipilih range 9, 9,5, 10, 10,5, 11 gram. Penambahan Tween 80 dan propilen glikol terhadap jumlah terhadap viskositas dan daya sebar dibuat grafik dan kemudian dilihat pada jumlah Tween 80 dan propilen glikol yang dapat memberikan respon viskositas dan daya sebar.
Proses pembuatan krim dilakukan dengan mencampurkan bahan-bahan sesuai dengan kelarutannya. Bahan-bahan yang memiliki kelarutan yang sama dicampurkan terlebih dahulu kedalam satu wadah. Bahan-bahan yang larut air dalam penelitian ini adalah propilen glikol, TEA, Tween 80 dan metil paraben, sedangkan kedua bahan yang larut minyak yaitu asam stearat dan BHT dicampurkan di tempat yang terpisah dari bahan yang larut air. Sebelum proses percampuran antara fase minyak dan air, asam stearat dan BHT dilelehkan pada suhu ± 65oC.
Fase minyak dan fase air masing – masing dipanaskan diatas penangas air. Jika fase minyak sudah meleleh sempurna, dilakukan percampuran kedua fase di dalam mortir yang telah dipanaskan terlebih dahulu dengan cara dimasukkan air hangat ke dalamnya. Tujuan pencampuran pada kondisi yang hangat adalah untuk mencegah pembekuan dari bahan-bahan yang telah dilelehkan sebelumnya yaitu asam stearat dan BHT. Akuades dan ekstrak batang jarak cina ditambahkan, dicampur dengan menggunakan mixer selama 2 menit dengan kecepatan yang konstan karena kecepatan pengadukan dan lama pengadukan dapat mempengaruhi stabilitas dan sifat fisik dari krim ekstrak batang jarak cina.
7. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik a. Uji organoleptis
Uji organoleptis dilakukan dengan cara mengamati warna, bau, homogenitas dari krim 48 jam setelah pembuatan.
b. Uji pH
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan kertas pH stick. Langkah yang dilakukan adalah dengan mengoleskan krim antibakteri ekstrak batang jarak cina ke kertas pH stick dan membandingkan dengan standar warna yang terdapat pada kemasan kertas pH stick.
c. Uji tipe krim
Sebanyak 0,5 gram krim dioleskan pada kaca preparat dan diratakan agar menyebar merata di atas kaca preparat. Krim kemudian ditetesi 1 tetes methylene blue. Warna yang dihasilkan diamati menggunakan mikroskop. Bagian yang berwarna biru menunjukkan fase air sedangkan bagian yang tidak berwarna merupakan fase minyak.
d. Uji ukuran droplet
Sejumlah krim dioleskan pada gelas obyek, kemudian ditutup menggunakan kaca penutup, diletakkan dibawah mikroskop. Ukuran droplet yang terdispersi dalam krim. Sebanyak 500 droplet diamati dengan perbesaran kuat (Martin, Swarbick, dan Cammarata, 1993).
e. Uji viskositas
Krim dimasukkan ke dalam wadah dan dipasang viskometer. Masing-masing formula krim sebanyak 200 gram ditentukan viskositasnya. Nilai viskositas krim ditunjukkan oleh jarum penunjuk saat viskometer dinyalakan. Pengujian dilakukan setelah jam ke 48, hari ke 7, 21, 28.
f. Uji daya sebar
Uji daya sebar dilakukan sesuai dengan penelitian Ikhsanudin dkk., (2012) yang telah mengalami modifikasi. Sebanyak 1 g krim antibakteri diletakkan ke bagian tengah kaca bulat. Kaca bulat tersebut ditutup dengan menggunakan kaca bulat yang lain di bagian atasnya. Diberikan beban di atasnya sebesar 125 gram, dibiarkan selama 1 menit. Diameter krim yang menyebar diukur selama 48 jam setelah pembuatan, 14 hari, 21 hari, dan 28 hari.
g. Uji iritasi dengan HET CAM
Telur ayam yang digunakan berusia 9-10 hari. Bagian bawah cangkang yang terdapat rongga udara dibuka dan diberikan krim sebanyak 0,3 gram pada membran chorioallantoic yang banyak mengandung pembuluh darah. Kontrol negatif yang digunakan adalah NaCl 0,9 % sedangkan kontrol positif yang digunakan adalah NaOH 0,1 N. Masing-masing kontrol diambil sebanyak 0,3 mL dengan spuit dan diletakkan diatas membran
pada pembuluh darah diamati. Apabila terjadi hemoragi, lisis, dan koagulasi, data yang diperoleh dari uji iritasi dimasukkan ke persamaan Irritation Score
(IS).