BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman ketapang dilakukan di Laboratorium Biologi
Farmasi, Fakultas Farmasi USD menurut buku Flora of Java (Backer and
Bakhuizen van den Brink, 1965).
2. Pengumpulan bahan
Buah ketapang diperoleh dari fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta pada bulan Mei 2007. Buah yang digunakan adalah buah yang masih
muda. Dikumpulkan pagi hari, pukul enam pagi.
3. Pembuatan ekstrak etanol buah ketapang
Ekstrak etanol disari dengan menggunakan cara perkolasi. Sebanyak 150 g
serbuk buah ketapang yang telah dihaluskan dan diayak dengan menggunakan
ayakan dengan derajat halus 8/24, direndam dalam cairan penyari yaitu etanol
70% (campuran etanol air (7:3)) dan didiamkan selama 24 jam dalam bejana
tertutup. Massa serbuk dan cairan penyari kemudian dimasukkan ke dalam
perkolator. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan tetesan 1 mL tiap menit.
Perkolat yang didapat ditampung, kemudian ampas diberi cairan penyari kembali
sampai perkolat yang keluar sudah jernih. Perkolat yang didapat dipekatkan
dengan vaccum rotaevaporator (rotavapor). Proses dilakukan sampai seluruh
etanol diperkirakan telah menguap. Ekstrak yang didapat, dikumpulkan dan
diuapkan di atas waterbath dengan suhu maksimum 50oC hingga diperoleh
ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapat, ditimbang untuk didapatkan
4. Pembuatan fraksi etil asetat buah ketapang
Ekstrak kental yang didapat dilarutkan dalam 100 mL air panas. Larutan
ekstrak didinginkan kemudian dimasukkan dalam corong pisah. Ditambahkan etil
asetat sebanyak 100 mL, kemudian digojog selama 15 menit dan didiamkan 5
menit. Ekstraksi dilakukan selama 9 kali (berdasarkan optimasi). Didapatkan
fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat dipekatkan dengan rotavapor.
Proses dilakukan sampai seluruh etil asetat diperkirakan telah menguap. Fraksi
yang didapat, dikumpulkan dan diuapkan di atas waterbath dengan suhu
maksimum 50oC hingga diperoleh fraksi kental. Fraksi kental yang didapat,
ditimbang untuk mendapatkan rendemen dan disimpan dalam eksikator.
5. Uji kualitatif kandungan flavonoid dengan metode KLT
Disiapkan larutan fraksi etil asetat buah ketapang. Sebanyak 10 µL larutan
tersebut ditotolkan pada lempeng selulosa dengan rutin (konsentrasi 0,05%)
sebagai pembanding. Lempeng KLT tersebut dielusi dengan fase gerak
N-butanol-Asam Asetat-Air (BAA) dengan perbandingan 4:1:5. Setelah dielusi
bercak diamati pada cahaya tampak, UV 365 nm, dan UV 254 nm. Deteksi
dengan uap amonia dan pereaksi semprot FeCl3 dilakukan untuk memperjelas
bercak. Bercak juga diamati pada cahaya tampak, UV 365nm, dan UV 254 nm.
6. Pembuatan buffer fosfat
Buffer fosfat dibuat dengan bantuan pH meter
a. Pembuatan dinatrium hidrogen fosfat 20 mM
Timbang saksama 1,42 g Na2HPO4 dan larutkan dalam akuades hingga
b. Pembuatan kalium dihidrogen fosfat 20mM
Timbang saksama 0,68g KH2PO4 dan larutkan dalam akuades hingga
250,0mL. Larutan KH2PO4 ditambahkan secara bertetes-tetes pada larutan
Na2HPO4 hingga tercapai pH 7,4.
7. Pembuatan pereaksi
a. Larutan FeCl3 1 mM
Sebanyak lebih kurang 13,52 mg FeCl3.6H2O ditimbang saksama dan
dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 2,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL
kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu
dibuat baru.
b. Larutan EDTA 1 mM
Sebanyak lebih kurang 18,61 mg Na2EDTA.2H2O ditimbang saksama dan
dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 2,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL
kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.
c. Larutan vitamin C 1mM
Sebanyak lebih kurang 17,61 mg vitamin C ditimbang saksama dan
dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL
kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu
d. Larutan H2O2 20 mM
Sebanyak 0,045 mL larutan H2O2 30% dimasukkan ke dalam labu ukur
10,0mL dan ditambahkan akuades hingga tanda. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL
kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.
e. Larutan TCA 5%
Sebanyak 1,25 g TCA ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades
hingga 25,0 mL dalam labu ukur.
f. Larutan TBA 1%
Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam beaker
glass 100 mL, ditambahkan akuades secukupnya kemudian dipanaskan di
atas hot plate pada suhu 50-55oC hingga larut. Larutan dimasukkan ke
dalam labu ukur 25,0 mL dan ditambah akuades hingga tanda.
g. Pembuatan larutan kuersetin 8,16 mg/mL
Sebanyak 816,0 mg serbuk kuersetin dimasukkan dalam labu takar 100,0mL
dan ditambahkan metanol hingga batas tanda.
h. Pembuatan larutan natrium nitrit 10%.
Sebanyak 10,0g natrium nitrit dilarutkan dengan aquades secukupnya dalam
beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 100,0mL dan
i. Pembuatan larutan aluminium klorida 10%
Sebanyak 5,0 g aluminium klorida dilarutkan dengan aquades secukupnya
dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 50,0mL
dan ditambahkan aquades hingga batas tanda.
j. Pembuatan larutan natrium hidroksida 10%
Sebanyak 10,0 g natrium hidroksida dilarutkan dengan aquades secukupnya
dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar
100,0mL dan ditambahkan aquades hingga batas tanda.
8. Optimasi Metode
a. Penentuan waktu operasi
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600μL larutan Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit.
Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5 %, vorteks
campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30
menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air
mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang maksimum teoritis 532 nm selama 30 menit.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM.
Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit.
Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5 %, vorteks
campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30
menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air
mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya dari panjang
gelombang 400-600 nm.
9. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang
a. Pembuatan larutan kontrol
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC
selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5%,
vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC
selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah
air mengalir selama 5 menit.
b. Penentuan aktivitas penangkapan radikal hidroksil
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan Deoksiribosa 2,5mM dan fraksi etil asetat buah ketapang sebanyak 200, 400,
600, 800, dan 1000 μL, kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, buffer fosfat pH 7,4 (penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume fraksi
300μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL
TCA 5%, vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada
suhu 80oC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran
didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.
10. Penentuan kadar flavonoid total
a. Pembuatan kurva baku kuersetin
Dibuat larutan induk kuersetin dengan konsentrasi 8,16 mg/mL dalam
aquades. Sebanyak 100; 200; 300; 400; 500; 600; 750; dan 900 μL larutan induk dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL, ditambahkan 4,0 mL
aquades dan 0,30 mL larutan NaNO2 10%, lalu dibiarkan selama 6 menit.
Kemudian ditambahkan dengan 4,0 mL NaOH 10% dan aquades sampai
volume 10,0 mL. Larutan dibiarkan selama 15 menit dan absorbansinya
dibaca pada panjang gelombang 510 nm.
b. Penentuan kadar flavonoid total dalam fraksi etil asetat
Ditimbang lebih kurang fraksi etil asetat sebanyak 25 mg kemudian
ditambahkan metanol dalam labu ukur sampai 100 mL, sehingga konsentrasi
awal 0,025 g/100 mL. Diambil 250 µL larutan fraksi, ditambahkan metanol
dalam labu ukur 10 mL sampai tanda, sehingga konsentrasinya menjadi
0,00625 g/100 mL = 6,25 mg/100 mL = 6,25 mg%. Larutan kedua yang
digunakan dalam penentuan kadar flavonoid total, yang selanjutnya
Diambil 250 μL sampel dan dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku. Kadar
flavonoid total dinyatakan sebagai gram ekuivalen kuersetin dalam setiap
100g berat kering ekstrak (g Ekivalen Kuersetin/100g).