BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Determinasi daun senggani dilakukan oleh BPTO Tawangmangu, Jawa Tengah sebagai pihak yang menyediakan daun senggani. Surat pengambilan dan determinasi daun senggani dari BPTO dapat dilihat pada lampiran 22.
2. Pembuatan ekstrak etanol daun senggani
Metode pembuatan ekstrak ini adalah dengan metode perkolasi. Langkah awalnya adalah daun senggani yang sudah kering dihaluskan dengan blender. Sebanyak 150 gram serbuk dimasukkan ke dalam perkolator, kemudian direndam dengan etanol 70% sampai mencapai ketinggian 1,5 cm diatas permukaan serbuk selama 24 jam. Keran perkolator dibuka dan kecepatan alir 20 tetes per menit. Selama proses perkolasi berlangsung tinggi etanol diatas permukaan serbuk harus
tetap 1-1,5 cm. Perkolat ditampung dalam erlenmeyer. Ekstraksi dihentikan jika perkolat yang keluar berwarna bening. Perkolat yang diperoleh diuapkan di atas waterbath hingga diperoleh perkolat yang kental (pekat). Ekstrak pekat kemudian disimpan di dalam lemari pendingin (kulkas).
3. Persiapan hewan uji
Metode uji efek anti inflamasi yang digunakan, baik untuk kelompok uji pendahuluan maupun kelompok perlakuan menggunakan metode pembentukan udema pada telapak kaki belakang hewan uji yang telah dimodifikasi oleh Langford et al. (1972). Hewan uji yang dibutuhkan adalah 83 ekor mencit putih betina. Delapan puluh tiga ekor mencit dibagi 2 kelompok. Kelompok pertama untuk uji pendahuluan 48 ekor, dan kelompok kedua sebanyak 35 ekor untuk perlakuan. Sebelum digunakan hewan uji dipuasakan selama dua puluh empat jam tanpa menghentikan pemberian minum.
a. dua belas ekor untuk uji pendahuluan waktu pemotongan kaki setelah injeksi karagenin 1 %
b. dua belas ekor untuk uji pendahuluan pemberian dosis efektif natrium diklofenak (dalam 4 peringkat dosis)
c. dua belas ekor untuk uji pendahuluan waktu pemberian dosis natrium diklofenak dengan dosis efektif
d. dua belas ekor untuk uji pendahuluan waktu pemberian ektrak etanol daun senggani
e. tiga puluh lima ekor untuk perlakuan kontrol negatif karagenin 1%, kontrol negatif CMC Na 1%, kontrol positif natrium diklofenak dan kelompok perlakuan ektrak etanol senggani dalam empat peringkat dosis, yaitu 850 mg/kgBB, 1000 mg/kgBB, 1330 mg/kgBB, dan 1670 mg/kgBB, masing-masing lima ekor.
4. Pembuatan suspensi karagenin 1 %
Timbang 100 mg karagenin, kemudian larutkan dalam 10 ml larutan NaCl fisiologis dan diaduk sehingga diperoleh konsentrasi suspensi karagenin 1%. Agar bisa digunakan kembali, suspensi karagenin disimpan dalam freezer.
5. Pembuatan CMC Na 1%
Timbang 1 gram CMC-Na, disuspensikan sampai 100 ml dengan aquadest hangat, kemudian aduk sampai homogen.
6. Pembuatan larutan natrium diklofenak
Ditimbang seksama sejumlah natrium diklofenak dan dilarutkan dalam CMC-Na 1% sampai diperoleh konsentrasi tertentu berdasar uji pendahuluan dosis. CMC-Na 1% dalam kondisi masih hangat sangat membantu kelarutan natrium diklofenak.
7. Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun senggani
Ditimbang seksama ekstrak etanol daun senggani dan disuspensikan ke dalam larutan CMC-Na 1% sampai diperoleh konsentrasi tertentu berdasarkan orientasi.
8. Penetapan dosis a. Karagenin 1%
Menurut Williamson (1996), konsentrasi karagenin yang digunakan pada mencit adalah 1% dengan volume 0,05 ml. 0,05 ml karagenin 1% adalah volume pemberian untuk mencit dengan berat 20 gram sehingga dosis bisa dicari dengan rumus: V ml = ml mg C kg BB X kgBB mg D / / 0,05 ml = ml mg kg X kgBB mg D / 10 02 , 0 / D = 25 mg/kg BB dan V = {2,5 x BB kg} ml b. Natrium Diklofenak
Dosis yang digunakan berdasarkan dosis natrium diklofenak yang pernah digunakan pada penelitian anti inflamasi yang sudah pernah dilakukan yaitu 9,75 mg/kg BB; 10,795 mg/kg BB, dan 11,95 mg/kg BB (Novita, 2003). Dosis ini berdasarkan dosis pemakaian natrium diklofenak pada manusia sebesar 75-150 mg/70kgBB. Dosis pada manusia tersebut dikonversikan ke mencit 20g dengan faktor konversi sebesar 0,0026. Contoh perhitungannya :
Dosis I : untuk manusia 70 kgBB = 75 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 75 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,195 mg/20 gBB
= 9,75 mg/kgBB Dosis II : untuk manusia 70 kgBB = 83,0385 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 83,0385 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,2195 mg/20 gBB
= 10,79 mg/kgBB Dosis III : untuk manusia 70 kgBB = 91,923 mg
konversi ke mencit 20 gBB = 91,923 mg/70kgBB x 0,0026 = 0,239 mg/20 gBB
= 11,95 mg/kgBB c. CMC 1%
Sebagai kontrol negatif CMC 1% diberikan secara per oral, dan volume pemberian maksimal pada mencit adalah 1ml, diketahui berat mencit maksimal dalam penelitian ini adalah 30 g sehingga bisa dihitung dengan rumus:
V ml = ml mg C kg BB X kgBB mg D / / 1 ml = ml mg kg X kgBB mg D / 10 03 , 0 / D = 333,3 mg/kg BB dan V = {33,3 x BB kg} ml d. Ekstrak etanol daun senggani
Dosis maksimum dan peringkat dosis ekstrak etanol daun senggani yang digunakan berdasarkan orientasi dan penelitian Tusthi (2006). Adapun peringkat dosis yang digunakan adalah 850 mg/kg BB, 1000 mg/kg BB, 1330 mg/kg BB, dan 1670 mg/kg BB.
9. Uji pendahuluan rentang waktu pemotongan kaki setelah injeksi karagenin Hewan uji dibagi dalam empat kelompok, tiap kelompok terdiri dari 3 ekor, diberi perlakuan pada kaki kiri bagian belakang diinjeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1% secara subplantar dengan kaki kanan hanya diinjeksi dengan spuit injeksi
sublantar tanpa suspensi karagenin 1%. Selanjutnya tiap kelompok hewan uji dikorbankan pada selang waktu tertentu, yaitu 1, 2, 3, dan 4 jam setelah injeksi karagenin 1% subplantar, dan kedua kaki belakangnya dipotong pada sendi torsocrural kemudian ditimbang. Waktu yang menunjukkan berat udema paling besar dijadikan acuan untuk perlakuan dengan karagenin 1% selanjutnya.
10. Uji pendahuluan dosis efektif natrium diklofenak
Hewan uji dibagi empat kelompok, tiap kelompok 3 ekor,diberi perlakuan natrium diklofenak peroral dengan dosis yang berbeda, kelompok I dengan dosis 9,75 mg/kgBB; dan kelompok II dengan dosis 10,795 mg/kgBB dan kelompok III dengan dosis 11,95 mg/kg BB. Kemudian kaki kiri bagian belakang diinjeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar, sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik dengan spuit injeksi secara subplantar tanpa suspensi karagenin 1%. Setelah beberapa lama, mencit dikorbankan, kedua kaki belakang dipotong pada sendi torsocrural kemudian ditimbang. Dosis yang menunjukkan berat udema paling kecil adalah dosis efektif dari natrium diklofenak.
11. Uji pendahuluan waktu pemberian natrium diklofenak dengan dosis efektif Hewan uji dibagi dalam empat kelompok, tiap kelompok terdiri tiga ekor dan diberi perlakuan dengan dosis efektif natrium diklofenak secara per oral, dalam rentang waktu tertentu, yaitu 15, 30, 45 dan 60 menit. Kemudian kaki kiri bagian belakang diinjeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar, kaki kanan bagian belakang disuntik dengan spuit injeksi secara subplantar tanpa suspensi karagenin
1%. Beberapa lama kemudian (berdasar uji pendahuluan waktu karagenin) mencit dikurbankan, kedua kaki belakangnya dipotong pada sendi torsocrural kemudian ditimbang. Waktu yang menunjukkan berat udema paling kecil dijadikan sebagai acuan untuk perlakuan dengan dosis efektif natrium diklofenak selanjutnya.
12. Uji pendahuluan waktu pemberian ektrak etanol senggani
Hewan uji dibagi empat kelompok, tiap kelompok terdiri 3 ekor, diberi perlakuan pemberian ektrak etanol daun senggani dengan dosis yang sama dalam rentang waktu tertentu. Tiap-tiap kelompok diberi secara per oral dalam rentang waktu 15, 30, 45 dan 60 menit sebelum injeksi 0,05 ml suspensi karagenin 1%. Setelah beberapa lama (berdasar uji pendahuluan waktu karagenin), mencit dikorbankan, kedua kaki belakang dipotong pada sendi torsocrural kemudian ditimbang. Waktu yang menunjukkan berat udema paling kecil dijadikan sebagai acuan untuk perlakuan dengan ekstrak etanol daun senggani selanjutnya.
13. Perlakuan hewan uji
Uji efek anti inflamasi ini menggunakan metode pembentukan udema pada telapak kaki belakang hewan uji yang telah dimodifikasi oleh Langford et al. (1972). Tiga puluh lima ekor mencit dibagi secara acak menjadi 7 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari lima ekor dengan perlakuan sebagai berikut :
a. kelompok I (kelompok kontrol karagenin 1%)
Kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik
subplantar tanpa karagenin. Setelah beberapa lama (berdasar uji pendahuluan) kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
b. kelompok II (kelompok kontrol CMC-Na 1%)
CMC-Na 1% diberikan secar per oral pada mencit dan setelah beberapa waktu (berdasar orientasi waktu natrium diklofenak dan ekstrak etanol daun senggani) kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
c. kelompok III ( kelompok kontrol natrium diklofenak)
Mencit diberi perlakuan per oral natrium diklofenak dengan dosis sesuai orientasi dan setelah beberapa waktu (berdasar orientasi) kaki kiri bagian belakang mencit diinjeksi dengan 0,05 ml suspensi karagenin 1% subplantar sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang. d. kelompok perlakuan ekstrak etanol daun senggani
Terdiri dari empat kelompok perlakuan yang diberikan 4 dosis ekstrak etanol daun senggani yang berbeda yaitu 850 mg/kg BB; 1000 mg/kg BB; 1330 mg/kg BB, dan 1670 mg/kg BB per oral. Setelah beberapa waktu (berdasar uji pendahuluan) masing-masing kelompok diinjeksi 0,05 ml karagenin 1% subplantar pada kaki kiri belakang sedangkan kaki kanan bagian belakang hanya disuntik subplantar tanpa karagenin, kemudian kedua kaki dipotong pada sendi torsocrural dan ditimbang.
14. Perhitungan % efek anti inflamasi
Data hasil penimbangan berat udema kaki belakang mencit digunakan untuk menghitung efek anti inflamasinya baik dari perlakuan natrium diklofenak (kontrol positif) maupun dari pemberian ekstrak etanol daun senggani, metode Langford et al. (1972) digunakan untuk mengetahui efek anti inflamasi ekstrak etanol daun senggani yang dihitung dalam persen (%) efek anti inflamasi dengan persamaan :
% efek anti inflamasi =
⎥⎦ ⎤ ⎢⎣ ⎡ − U D U X 100% keterangan :
U : Harga rata-rata berat kaki kelompok karagenin (terinflamasi) dikurangi rata-rata berat kaki kelompok normal ( tanpa perlakuan )
D : Harga rata-rata berat kaki kelompok perlakuan (terinflamasi) dikurangi rata-rata berat kaki normal ( tanpa perlakuan )
Untuk mengetahui potensi relatif efek anti inflamasi ekstrak etanol daun senggani terhadap larutan natrium diklofenak sebagai kontrol positif maka dapat digunakan rumus sebagai berikut :
Potensi relatif efek anti inflamasi = x DAd DAp
100%
keterangan :
DAp : persen (%) efek anti inflamasi pada kelompok perlakuan ekstrak etanol daun senggani