BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Molase diambil dalam satu waktu, sebanyak 10 liter setelah sebelumnya dihomogenkan dalam tangki, di PS Madukismo Yogyakarta. Sebelum digunakan untuk penelitian, molase dihomogenkan kembali di laboratorium Mikrobiologi Universitas Sanata Dharma.
2. Penyiapan kultur murni S. cerevisiae
Strain S. cerevisiae murni diperoleh dari Perusahaan Spiritus Madukismo Yogyakarta, yang telah diisolasi hingga menjadi kultur murni di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta oleh Septriani (2008).
34
3. Produksi etanol hasil fermentasi a. Persiapan bahan baku
1. Pembuatan larutan molase 16ºbrix sebanyak 2000 gram untuk tahap pembibitan.
375 gram molase 85,23°brix dimasukkan ke dalam elenmeyer, ditambahkan aquadest hingga 2000 gram, kemudian dikocok sampai homogen. Disaring dengan kain flanel, ditambahkan larutan H2SO4 tetes demi tetes, hingga pH 4,8, disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit dan dinginkan. Kemudian ditambahkan urea 0,616 gram dan NPK 0,463 gram kocok sampai homogen.
2. Pembuatan larutan molase 4, 16, dan 24ºbrix untuk fermentasi. Larutan molase dipersiapkan sesuai dengan konsentrasi dibawah ini sebanyak 1500 gram.
Tabel V. Jumlah molase pada proses fermentasi Konsentrasi molase (ºbrix) Molase (gram)
8 71 16 282 24 493 Larutan disaring dengan kain flanel, kemudian disterilisasi dengan
autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit dan dinginkan. Tambahkan urea sebanyak 0,462 gram di LAF, larutan dikocok sampai homogen.
b. Tahap pembibitan. Larutan molase 16°brix diambil sebanyak 30 ml untuk pembibitan, kemudian dimasukkan dalam elenmeyer, tambahkan tiga ose kultur murni S. cerevisiae, diinkubasi dalam shaker inkubator selama 49,5
jam pada suhu 30ºC dan kecepatan 150 rpm. Kontrol diperlakukan sama seperti sampel, namun tidak diberi S. cerevisiae.
c. Tahap fermentasi
1. Penentuan waktu fermentasi. Setelah diinkubasi selama 49,5 jam, dalam LAF, larutan molase yang berasal dari tahap pembibitan, dipindahkan ke dalam labu alas bulat. Kemudian ditambahkan 60 ml larutan molase 24ºbrix, dan larutan H2SO4 tetes demi tetes, hingga pH 4,5, kemudian dikocok hingga homogen. Larutan tersebut diinkubasi dalam inkubator suhu 31˚C selama 36, 48, 60 dan 72 jam secara anaerob dengan mengalirkan gas CO2 hasil fermentasi ke dalam larutan Ca(OH)2. Larutan disaring dengan kertas saring, dibantu dengan pompa vakum, dan didestilasi pada suhu ± 80°C selama 4 jam. Etanol hasil destilasi ditetapkan kadarnya dengan Kromatografi Gas. Replikasi dilakukan 6 kali. Waktu fermentasi ditentukan dari waktu yang memberikan kadar etanol paling tinggi.
2. Penentuan kondisi optimum fermentasi. Setelah diinkubasi selama 49,5 jam, dalam LAF, larutan molase yang berasal dari tahap pembibitan, dipindahkan kedalam labu alas bulat. Kemudian ditambahkan 60 ml larutan molase hingga ºbrix yang diinginkan, dan larutan H2SO4 tetes demi tetes, hingga pH yang diinginkan, dikocok hingga homogen. Larutan tersebut diinkubasi dalam inkubator suhu 31˚C selama 72 jam secara anaerob dengan mengalirkan gas CO2 hasil fermentasi ke dalam larutan Ca(OH)2. Larutan disaring dengan kertas saring dibantu dengan
36
pompa vakum, didestilasi pada suhu ± 80°C selama 4 jam. Etanol hasil destilasi ditetapkan kadarnya dengan Kromatografi Gas. Replikasi dilakukan 6 kali dan kontrol diperlakukan sama seperti sampel, namun tidak diberi S. cerevisiae.
Tabel VI. Variasi pH dan konsentrasi molase Suhu pH Konsentrasi molase
31˚C 4 8ºbrix 16ºbrix 24ºbrix 4,5 8ºbrix 16ºbrix 24ºbrix 5 8ºbrix 16ºbrix 24ºbrix
4. Penetapan kadar etanol hasil fermentasi
a. Preparasi sampel. Sampel hasil destilasi diambil 500 µl, dimasukkan ke dalam labu ukur 5,00 ml, ditambahkan 20 µl larutan n-butanol dan hexane hingga volume 5,00 ml. Larutan dikocok sampai homogeny. Diambil 1 µl larutan tersebut, kemudian diinjeksikan untuk ditetapkan kadarnya dengan kromatografi gas.
b. Optimasi metode kromatografi gas
1. Pemilihan kolom dan detektor yang sesuai.
Kolom yang dipilih adalah CP-Wax 52 CB yang merupakan kolom sangat polar dan cocok untuk penetapan kadar etanol. Detektor yang dipilih adalah FID karena memiliki sensitifitas yang tinggi terhadap senyawa-senyawa organik, termasuk etanol.
2. Optimasi suhu injektor, kolom dan detektor.
Suhu pada injektor, kolom dan detektor diatur agar larutan baku etanol, standar internal n-butanol dan hexane dapat teruapkan dan mempertahankan supaya tetap pada fase gas. Pengaturan suhu diatur mulai dari 50°C di atas titik didih n-butanol, yaitu 120°C dan kemudian diturunkan hingga diperoleh suhu yang optimal.
a. Optimasi kecepatan aliran gas pembawa N2. Kecepatan aliran gas pembawa diatur dengan mengubah tekanan head kolom. Tekanan awal yang diberikan adalah 30 kpa dan kemudian diatur sedemikian rupa sehingga diperoleh pemisahan yang baik antara komponen-komponen sampel.
b. Optimasi aliran gas pembawa H2 dan O2. Perbandingan kecepatan aliran gas H2 dan O2 adalah 10:1. Hal ini dilakukan dengan tujuan menghasilkan nyala yang stabil pada detektor.
c. Optimasi pemisahan (Resolusi sampel). Sampel yang telah dipreparasi diinjeksikan sebanyak 1 µl ke dalam kolom kromatografi gas, hitung resolusinya.
5. Validasi metode analisis
a. Pembuatan seri larutan baku etanol. Bahan yang digunakan untuk membuat seri larutan baku etanol adalah etanol p.a. dan sebagai standar internal digunakan n-butanol p.a kedua senyawa tersebut dilarutkan dalam larutan hexane. Disiapkan seri baku dengan konsentrasi berikut menggunakan labu ukur 5,00 ml. Replikasi dilakukan 3 kali.
38
Tabel VII. Seri larutan baku etanol dengan standar n-butanol
Etanol p.a (µl) n-butanol(µl) Konsentrasi akhir etanol %v/v
10 20 0,2
70 20 1,4
130 20 2,6
190 20 1,9
250 20 5,0
b. Pembuatan recovery dan kesalahan acak. Larutan etanol dibuat pada konsentrasi 0,2; 2,6, dan 5,0%, dengan standar internal n-butanol p.a, kedua senyawa tersebut dilarutkan dalam hexane hingga 5,00 ml dan dikocok hingga homogen. Tiap konsentrasi direplikasi sebanyak 3 kali.
c. Pembuatan kurva baku etanol. Satu mikroliter (1µl) larutan baku dari masing-masing konsentrasi disuntikkan ke dalam kolom melalui tempat injeksi. Dilakukan proses pemisahan dengan kromatografi gas, hingga diperoleh luas puncak kromatogram, dan dicari rasio luas puncak etanol/n-butanol. Kurva baku dibuat dengan memplotkan rasio luas puncak etanol/n-butanol vs kadar etanol (%v/v). Persamaan kurva baku dicari dengan regresi linear.
d. Validasi metode. Satu mikroliter (1µl) larutan etanol dari masing-masing konsentrasi pada butir (b), disuntikkan ke dalam kolom melalui tempat injeksi. Dilakukan proses pemisahan dengan kromatografi gas, hingga diperoleh luas puncak kromatogram, dan dicari rasio luas puncak etanol/n-butanol. Recovery ditentukan dengan membandingkan kadar terukur dan terhitung, sedangkan kesalahan acak ditentukan dari KV.
6. Penetapan kadar etanol hasil fermentasi
Sampel yang telah dipreparasi diinjeksikan satu mikroliter (1µl) ke dalam kolom melalui tempat injeksi. Dilakukan proses pemisahan dengan
kromatografi gas, hingga diperoleh luas puncak kromatogram, dan dicari rasio luas puncak etanol/n-butanol. Rasio tersebut dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku, dan hasilnya dikalikan dengan faktor pengenceran untuk didapat kadar etanol yang sebenarnya dalam destilat.