BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman apu-apu yang diperoleh dari Kebun Tanaman Obat
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dilakukan di
Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta berdasarkan USDA (2014) dengan mencocokkan karakteristik
tanaman apu-apu yang digunakan dengan gambar, taksonomi, dan keterangan
kelompok tumbuhan, seperti monokotil dan dikotil, dari USDA (2014).
2. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah akar apu-apu yang diperoleh dari
kolam di Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada Januari 2014. Pemanenan dilakukan saat pagi hari untuk
mengcegah kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman apu-apu
agar tidak diolah menjadi metabolit lainnya dalam proses fotosintesis yang
melibatkan cahaya matahari.
3. Preparasi akar apu-apu
Akar apu-apu sebanyak 600 gram dibersihkan dari pengotor-pengotor
dengan cara dicuci dengan air mengalir, kemudian diangin-anginkan. Akar
apu-apu yang telah cukup kering dihaluskan menggunakan blender dengan bantuan
sedikit metanol sebagai cairan penyari. Akar yang telah halus dituang ke dalam
bejana maserasi, lalu ditambahkan metanol hingga terendam sempurna. Maserasi
dilakukan selama 24 jam pada suhu ruang. Filtrat diperoleh melalui penyaringan
Ampas hasil maserasi pertama diremaserasi kembali selama 24 jam, lalu
dilakukan penyaringan kembali.Filtrat hasil maserasi diuapkan pelarutnya dengan
vacuum rotary evaporator, lalu dipekatkan di atas waterbath, dan oven pada suhu
40◦ C hingga diperoleh ekstrak metanol akar apu-apu dengan bobot tetap. Ekstrak
metanolik akar apu-apu digunakan untuk analisis selanjutnya.
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji
a. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan hingga 100,0 mL dengan
metanol, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM.
Larutan ditutup dengan alumunium foil dan selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok rutin
Sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan metanol hingga 10,0 mL.
c. Pembuatan larutan pembanding
Larutan stok rutin diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 mL
kemudian metanol p.a ditambahkan hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh
konsentrasi larutan standar rutin sebesar 5; 10; 15; 20; dan 25 µg/mL.
d. Pembuatan larutan uji
i. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan.
Sebanyak 25,0 mg ekstrak metanolik ditimbang, lalu
metanol p.a ditambahkan hingga 25 mL. Larutan tersebut
kemudian diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL, lalu
ditambah dengan metanol hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh
ii. Larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total.
Sebanyak 200 mg ekstrak metanolik ditimbang dan
dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh
konsentrasi larutan uji sebesar 20000 µg/mL.
e. Pembuatan larutan asam galat
Larutan asam galat dibuat dengan konsentrasi 500 µg/mL
dalam akuades dan metanol p.a dengan perbandingan 1:1 v/v.
Larutan tersebut diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL,
lalu ditambah dengan akuades : metanol p.a (1:1) ad hingga 10,0
mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat
sebesar 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL.
5. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sebanyak 0,5 ml larutan uji dan larutan pembanding asam galat
dengan konsentrasi 150,0 µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL reagen
Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan akuades dengan perbandingan
1:10 v/v dalam tabung reaksi. Campuran didiamkan selama 10 menit,
lalu ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna
larutan diamati secara visual dengan mata.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam
reaksi ditambahkan 1,0 mL metanol p.a, larutan pembanding rutin 25
µg/mL, dan larutan uji 500,0 µg/mL. Campuran tersebut ditambah
dengan 3 mL metanol p.a, lalu divortex selama 30 detik. Setelah 30
menit, warna larutan tersebut diamati secara visual dengan mata.
6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dengan konsentrasi 50, 100,
dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang
telah diencerkan dengan akuades dengan perbandingan 1:10 v/v. Setelah
itu, 4,0 mL larutan natrium karbonat 1M ditambahkan dan dibaca
serapannya menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang
gelombang 760 nm selama 30 menit.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dengan konsentrasi 50, 100,
dan 150 µg/mL ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang
telah diencerkan dengan air dengan perbandingan 1:10 v/v. Setelah itu,
sebanyak 4,0 mL larutan natrium karbonat 1M ditambahkan dan
didiamkan selama operating time. Scanning panjang gelombang
maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin Ciocalteu
dilakukan pada rentang panjang gelombang 600-800 nm, di mana panjang
gelombang teoritisnya yaitu 760 nm, sehingga masuk dalam rentang
7. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dengan konsentrasi 50, 75,
100, 125, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciaocalteu
yang telah diencerkan dengan air dengan perbandingan 1:10 v/v. Setelah
itu, 4,0 mL larutan natrium karbonat 1M ditambahkan dan didiamkan
selama operating time. Serapan dibaca pada panjang gelombang
maksimum terhadap blanko yang terdiri dari akuades dan metanol p.a
dengan perbandingan 1:1 v/v, reagen Folin-Ciaocalteu, dan larutan
natrium karbonat 1M. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Larutan uji diambil sebanyak 0,5 mL, lalu dimasukkan ke dalam
labu ukur 10 mL, kemudian diberi perlakuan seperti pada pembuatan
kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram
ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik).
Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH, 1 mL larutan pembanding rutin 5;
15; dan 25 µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam tiga buah labu
ukur 5 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas.
Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan
selama 60 menit. Pada larutan uji 100, 200, dan 300 µg/mL juga
dilakukan perlakuan yang sama.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 ml larutan DPPH masing-masing
dimasukkan ke dalam tiga buah labu ukur 10 mL, kemudian ditambah
dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi
DPPH 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan divortex selama 30 detik,
lalu didiamkan selama operating time teoritis 30 menit. Setelah itu
dilakukan scanning panjang gelombang maksimum dengan menggunakan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
9. Uji aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur
10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan
dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada
panjang gelombang maksimum yang didapatkan dari scanning panjang
gelombang maksimum, setelah operating time. Replikasi dilakukan
sebanyak 3 kali.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke labu ukur 10 mL,
kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan larutan uji
pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Setelah itu, metanol p.a
didiamkan selama operating time (OT), kemudian dilakukan pembacaan
serapan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang
maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
c. Estimasi aktivitas antioksidan
Penghitungan nilai %IC dan IC50 dilakukan berdasarkan hasil dari
prosedur 9 a dan b untuk rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu.