BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
a. Pembuatan larutan kuersetin 1 mg/ml
Sebanyak 0,05 g kuersetin standar dilarutkan dengan aseton 75% dalam labu ukur 50,0 ml kemudian diencerkan hingga tanda. Larutan stok dibuat 3 replikasi.
b. Penetapan operating time
Diambil sebanyak 4,0 ml larutan stok dan diencerkan dengan aseton 75% dalam labu ukur 10,0 ml hingga tanda. Sebanyak 0,50 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml. Pereaksi Folin-Ciocalteu 2 N ditambahkan sebanyak 2,50 ml dan dibiarkan selama 2 menit. Larutan Na2CO3 1,9 M sebanyak 7,50 ml ditambahkan
kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex lalu absorbansi diukur pada panjang gelombang 726 nm selama 120 menit. c. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum
Diambil larutan stok sebanyak 4,0 ml dan diencerkan dengan aseton 75% dalam labu ukur 10,0 ml hingga tanda. Sebanyak 0,50 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml. Pereaksi Folin-Ciocalteu 2 N ditambahkan sebanyak 2,50 ml dan dibiarkan selama 2 menit. Larutan Na2CO3 1,9 M sebanyak 7,50 ml ditambahkan kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik, diinkubasi selama operating time, kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 600-800 nm.
d. Penetapan kurva baku
Sebanyak 0,05 g kuersetin standar dilarutkan dengan aseton 75% sampai volume 50,0 ml. Konsentrasi kuersertin dibuat 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; dan 0,6 mg/ml menggunakan aseton 75%. Sebanyak 0,50 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml. Pereaksi Folin-Ciocalteu 2 N ditambahkan sebanyak 2,50 ml dan dibiarkan selama 2 menit. Larutan Na2CO3 1,9 M sebanyak 7,50 ml ditambahkan kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik, diinkubasi selama operating time, kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi larutan diukur pada
panjang gelombang serapan maksimum. Penetapan kurva baku dilakukan sebanyak 3 kali.
e. Penetapan kadar polifenol dalam ekstrak keringteh hijau
Sebanyak 500 mg ekstrak kering teh hijau dimasukkan dalam labu ukur 25,0 ml kemudian dilarutkan dengan aseton 75% dan diencerkan hingga tanda. Sebanyak 1,0 ml larutan tersebut diambil kemudian dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml dan diencerkan dengan akuades hingga tanda. Sebanyak 0,50 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 50,0 ml. Pereaksi Folin-Ciocalteu 2 N ditambahkan sebanyak 2,50 ml dan dibiarkan selama 2 menit. Larutan Na2CO3 1,9 M sebanyak 7,50 ml ditambahkan kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan divortex selama 30 detik, diinkubasi selama
operating time, kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang serapan maksimum. Replikasi dilakukan 6 kali. Kadar polifenol dalam sampel dihitung dengan persamaan kurva baku sehingga diperoleh konsentrasi polifenol terhitung ekuivalen terhadap kuersetin.
2. Penetapan nilai SPF
a. Pembuatan larutan stok polifenol teh hijau 30,0 mg%
Serbuk ekstrak kering teh hijau ditimbang setara 15,0 mg polifenol teh hijau kemudian dilarutkan dengan etanol 90% dalam labu ukur 50,0 ml kemudian diencerkan hingga tanda.
b. Penentuan spektra UV ekstrak kering teh hijau
Diambil larutan stok polifenol teh hijau sebanyak 2,0 ml dan dimasukkan dalam labu ukur 10,0 ml, encerkan dengan etanol 90% hingga tanda. Spektra UV larutan diperoleh dengan scanning absorbansi larutan pada panjang gelombang 250-400 nm.
c. Penentuan nilai Sun Protection Factor (SPF)
Larutan stok polifenol teh hijau diambil sebanyak 2,0; 4,0 dan 6,0 ml, diencerkan dengan etanol 90% dalam labu ukur 10,0 ml hingga diperoleh larutan polifenol teh hijau dengan konsentrasi 6,0; 12,0; dan 18,0 mg%. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk tiap konsentrasi.
Absorbansi (A) masing-masing konsentrasi diukur tiap 5 nm pada rentang panjang gelombang 290 nm hingga 410 nm. Dibuat kurva antara nilai absorbansi terhadap panjang gelombang. Kemudian dihitung luas area di bawah kurva (Area Under the Curve-AUC) menggunakan metode trapesium. Harga SPF dihitung dengan rumus:
Log SPF = AUC
λn−λl ……….……….………(5)
yaitu luas area di bawah kurva dibagi selisih λ pengamatan (Petro, 1981).
3. Pembuatan formula krim sunscreen ekstrak kering teh hijau
Dalam penelitian ini digunakan formula standar (Michael, 1977) yang telah dimodifikasi.
Tabel III. Formula Standar dan Formula Modifikasi
Formula Standar (gram) Modifikasi (gram) Fase A Asam stearat 10,0 Asam stearat 10,0
Mineral oil 6,0 VCO 10,0
Petrolatum 4,0 Setil alkohol 2,0
Lanolin 2,0 Span 80 2,0
Castor oil 1,0 Tween 80 3,0 Setil alkohol 1,0
Arlacel 60 2,0 Tween 80 1,0
Fase B Gliserol 1,0 Gliserol 2,0
Trietanolamin 0,6 Trietanolamin 0,6 Akuades 71,4 Asam sitrat 0,35
Preservative q.s. Metil paraben 0,2
Ekstrak teh hijau 0,07
Akuades 40,0
Perfume q.s
4. Pembuatan krim
Asam stearat dan setil alkohol masing-masing dilelehkan pada suhu 60 oC. Fase A dicampur dalam satu cawan porselin dan diaduk merata pada suhu 60 oC. Asam sitrat dan ekstrak teh hijau masing-masing dilarutkan dalam sedikit akuades. Akuades sisa dipanaskan dalam cawan porselin lain pada suhu 60 oC, kemudian ditambahkan metil paraben, gliserol dan TEA (fase B). Fase A dituangkan ke dalam fase B pada suhu 60 oC di atas
waterbath yang telah diatur suhunya. Kemudian pencampuran kedua fase dilakukan menggunakan mixer dengan kecepatan 300 dan 500 rpm selama 10 dan 20 menit. Setelah dingin, asam sitrat yang telah dilarutkan dalam akuades ditambahkan perlahan, kemudian ditambahkan pula larutan ekstrak kering teh hijau dan perfume.
Tabel IV. Rancangan Desain Faktorial: Level Rendah dan Level Tinggi Kecepatan Putar dan Lama Pencampuran
Percobaan Kecepatan putar (rpm) Lama pencampuran (menit)
(1) 300 10
a 500 10
b 300 20
5. Pengambilan sampel
Dalam penelitian ini dibuat 3 kali replikasi pada tiap setiap formula percobaan (1), a, b, dan ab. Masing-masing replikasi tersebut kemudian diuji dan diamati tipe krim, daya sebar krim, viskositas krim, mikromeritik, dan
index creaming emulsi.
6. Uji tipe krim
a. Metode Warna
Sebanyak 0,5 g krim sunscreen dimasukkan ke dalam beaker glass dan diencerkan dengan 2 ml aquades. Campuran diaduk kemudian ditambah 2 tetes methylene blue. Warna campuran diamati. Bagian yang berwarna biru menunjukkan fase air sedangkan bagian yang tidak berwarna merupakan fase minyak (Voigt, 1994).
b. Metode Pengenceran
Sedikit air diberikan ke dalam contoh kecil emulsi dan setelah dikocok atau diaduk diperoleh kembali suatu emulsi homogen, maka terdapat tipe M/A. Pada tipe A/M terjadi sebaliknya (Voigt, 1994).
c. Metode Pencucian
Tipe emulsi M/A dapat dengan mudah dicuci dengan air dari tangan atau benda. Penghilangan emulsi tipe A/M menurut pengalaman sering menunjukkan kesulitan yang berarti (Voigt, 1994).
7. Uji daya sebar krim
Uji daya sebar dilakukan 48 jam setelah pembuatan dengan cara: krim ditimbang seberat 1 gram, diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di
atas krim diletakkan kaca bulat lain sebagai pemberat sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat penyebarannya (Garg et al., 2002).
8. Uji viskositas krim
Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscotester Rion seri VT-04 dengan cara: krim dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas krim diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Uji ini dilakukan 2 kali, yaitu 48 jam setelah krim dibuat dan setelah disimpan selama 1 bulan (Hariyadi, Purwanti, dan Soeratri, 2005).
9. Uji mikromeritik
Oleskan sejumlah krim pada gelas objek kemudian letakkan meja benda pada mikroskop. Amati ukuran droplet yang terdispersi pada krim. Gunakan perbesaran lemah untuk menentukan objek yang akan diamati kemudian ganti dengan perbesaran kuat. Catat diameter terjauh dari tiap droplet sejumlah 500 droplet (Martin et al., 1993).
10. Uji index creaming emulsi
Dilakukan dengan menghitung rasio volume emulsi yang mengalami pemisahan dibanding volume total emulsi (Aulton, 2002).