BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
a. Pengamatan organoleptis. Dilakukan pengamatan organoleptis terhadap minyak kayu manis yang digunakan dalam penelitian, meliputi : bentuk, warna, dan bau.
b. Pengujian indeks bias. Indeks bias minyak kayu manis diukur menggunakan hand refractometer. Pentutup prisma dibuka kemudian diteteskan sebanyak 1 atau 2 tetes minyak kayu manis pada prisma utama. Penutup prisma ditutup perlahan sampai menyentuh prisma utama. Skala 1, 2, atau 3 diatur dengan memutar knob hingga tanda tergantung dari konsentrasi sampel yang diuji. Jarak jangkauan adalah skala 1 untuk indeks bias 1,333 – 1,404 (skala sebelah kiri), skala 2 untuk indeks bias 1,404 –
1,468 (skala tengah), dan skala 3 untuk indeks bias 1,468 – 1,520 (skala sebelah kanan)
Ujung hand refractometer diarahkan ke arah cahaya yang terang, dilihat melalui lensa sambil diputar-putar hingga skala terlihat jelas. Tampak garis batas yang memisahkan sisi yang terang dan gelap pada bagian atas dan bawah. Jika garis batas berwarna atau tidak jelas, maka ring diputar untuk menghilangkan warna hingga batas terlihat jelas.
c. Penentuan bobot jenis. Piknometer ditimbang beserta termometer dan penutup pipa kapiler, kemudian diisi dengan air hingga penuh dan direndam dalam air es hingga suhunya ±20°C di bawah suhu percobaan. Kemudian piknometer ditutup dan pipa kapiler dibiarkan terbuka sampai mencapai suhu percobaan. Setelah itu, pipa kapiler piknometer ditutup dan dibiarkan suhu air dalam piknometer mencapai suhu kamar. Cairan yang menempel di dinding luar piknometer diusap dan ditimbang kembali dengan seksama, kemudian dibandingkan dengan tabel kerapatan air pada beberapa temperatur. Volume air yang didapatkan merupakan volume piknometer tersebut. Hal yang sama dilakukan dalam penentuan kerapatan minyak kayu manis menggunakan piknometer yang sama. Bobot minyak kayu manis sama dengan kerapatan minyak kayu manis dibagi kerapatan air pada suhu 25°C.
2. Sterilisasi peralatan dan media
Peralatan yang digunakan dalam penelitian (terutama yang berhubungan dengan bakteri uji seperti tabung reaksi dan cawan petri) disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 20 menit. Untuk pipet ukur disterilisasi menggunakan oven pada suhu 50°C.
3. Penyiapan media
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah Trypton Soya Agar (TSA) dan Trypton Soya Broth (TSB). Pemilihan kedua media tersebut terkait nutrisi yang sesuai bagi pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Komposisi pembuatan adalah 1 gram TSA / 25 mL akuades dan 1 gram TSB / 33,2 mL akuades. Setelah media dipanaskan menggunakan hot plate dengan bantuan
stearer, media tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Untuk penyiapan stok mikroba uji, media TSA yang sudah steril dikondisikan dalam keadaan miring di tabung reaksi. Setelah memadat, media siap digunakan untuk reisolasi bakteri Streptococcus mutans.
4. Pembuatan suspensi bakteri
Sebanyak 1-3 ose isolat murni bakteri Streptococcus mutans
diinokulasikan ke dalam tabung reaksi berisi 5 ml TSB, lalu divortex supaya tercampur merata dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Untuk pembuatan suspensi bakteri, bakteri dalam media TSB yang sudah diinkubasi kemudian ditambahkan TSB steril hingga kekeruhannya setara dengan larutan
standar Mc Farland 0,5. Pembuatan suspensi bakteri dilakukan di
Microbiological Safety Cabinet (MSC).
5. Uji aktivitas antibakteri minyak kayu manis terhadap bakteri Streptococcus mutans dengan metode difusi sumuran.
Pengujian potensi daya antibakteri minyak kayu manis terhadap bakteri
Streptococcus mutans dilakukan dengan pembuatan sumuran pada media yang dibuat dengan menggunakan metode double layer, dimana sebanyak 10 mL media TSA dituang ke dalam petri sebagai base layer kemudian dibiarkan memadat terlebih dahulu. Sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri Streptococcus mutans yang sudah disetarakan dengan larutan standar McFarland 0,5 diinokulasikan ke dalam 30 mL media TSA pada suhu 45-50°C (sebagai seed layer), lalu dituang ke dalam petri berisi base layer yang sudah memadat. Setelah memadat, lalu dibuat sumuran sampai batas antara base layer dan seed layer secara aseptis.
Setiap petri yang berisi media TSA dibuat sumuran sebanyak 6 lubang menggunakan pelubang berdiameter 7 mm. Uji potensi daya antibakteri minyak kayu manis dilakukan replikasi sebanyak 6 kali, dimana setiap replikasi terdiri dari 2 petri (petri A dan petri B). Setiap sumuran pada petri A diisi minyak kayu manis dengan konsentrasi 1; 2; 3; 4; 5% dan parafin cair sebagai kontrol negatif masing-masing sebanyak 0,020 mL. Sedangkan untuk setiap sumuran di petri B diisi minyak kayu manis dengan konsentrasi 6; 7; 8; 9; 10% dan parafin cair
sebanyak 0,020 mL. Proses pengerjaan dilakukan di Microbiological Safety Cabinet (MSC).
Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, lalu diukur zona hambat yang terbentuk menggunakan jangka sorong digital. Diameter zona hambat yang terbentuk dikurangi diameter sumuran yang digunakan yaitu 7 mm. Daya antibakteri diamati berdasarkan diameter zona hambat yang dihasilkan dibandingkan dengan kontrol negatif.
6. Penentuan nilai KHM dan KBM minyak kayu manis
a. Penentuan nilai KHM dengan metode dilusi padat. Media TSA dibuat dengan mencampurkan 9 gram serbuk TSA dan 225 ml akuades. Media TSB dibuat dengan mencampurkan sebanyak 0,6 gram serbuk TSB dan 20 mL akuades. Kedua media tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Sebanyak 15 mL media TSA dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diinokulasikan sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri Streptococcus mutans yang sudah disetarakan dengan larutan McFarland 0,5. Setelah itu dimasukkan sebanyak 0,2 mL minyak kayu manis dengan konsentrasi yang mempunyai potensi antibakteri berdasarkan metode difusi sumuran , lalu dituang ke dalam petri steril. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, lalu bandingkan kekeruhan hasilnya dengan kontrol negatif dan diberi penilaian menggunakan notasi (+) untuk media yang tampak keruh dan (-) jika tidak
ada kekeruhan. Hasil pengamatan dianalisis untuk mendapatkan konsentrasi atau Kadar Hambat Minimal (KHM) minyak kayu manis. b. Uji penegasan KHM dan KBM dengan metode streak plate. Media TSA
dibuat dengan mencampurkan sebanyak 1,33 gram serbuk TSA dan 33 mL akuades. Kemudian media disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah media TSA jadi, lalu dituang ke dalam petri steril dan biarkan hingga memadat. Kemudian dilakukan penggoresan bakteri dari hasil uji dilusi padat ke media TSA baru dengan metode streak plate. Diamati hasilnya setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Bila ditemukan adanya pertumbuhan, dilakukan uji penegasan kedua dengan melakukan penggoresan dari hasil uji penegasan pertama ke media TSA baru dengan metode streak plate. Setelah diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37°C, bila pada petri masih menunjukkan pertumbuhan bakteri maka dinyatakan sebagai nilai KHM. Sedangkan bila pada petri tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri maka dinyatakan sebagai nilai KBM.
7. Penentuan kerapatan minyak kayu manis pada kadar bunuh minimum (KBM)
Piknometer ditimbang beserta termometer dan penutup pipa kapiler, kemudian diisi dengan air hingga penuh dan direndam dalam air es hingga suhunya ±20°C di bawah suhu percobaan. Kemudian piknometer ditutup dan pipa kapiler dibiarkan terbuka sampai mencapai suhu percobaan. Setelah itu, pipa
kapiler piknometer ditutup dan dibiarkan suhu air dalam piknometer mencapai suhu kamar. Cairan yang menempel di dinding luar piknometer diusap dan ditimbang kembali dengan seksama. Hitung minyak kayu manis pada KBM.
8. Formula pasta gigi
Tabel I. Formula pasta gigi minyak kayu manis (100 g)
Bahan pasta gigi F1 (g) F2 (g) F3 (g) F4 (g) F5 (g) F6 (g)
HPMC 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
Sorbitol 15 15 15 15 15 15
Gliserin 23 23 23 23 23 23
Kalsium karbonat 43 43 43 43 43 43
Xylitol 1 1 1 1 1 1
Sodium lauril sulfat 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Pipermint 4 4 4 4 4 4
Metil paraben 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Akuades 4,75 4,75 4,75 4,75 4,75 4,75
Minyak kayu manis 8 8 8 8 8 8
9. Pembuatan pasta gigi
Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan pasta gigi ditimbang sesuai dengan formula. HPMC dikembangkan dalam 18 mL gliserin selama 15 menit dalam mortir besar. Pada cawan porselen lainnya, metil paraben dan sodium lauril sulfat masing-masing dilarutkan dalam sisa gliserin. Minyak kayu manis dan minyak pipermint dicampurkan dalam cawan porselen, lalu diaduk menggunakan batang pengaduk sampai homogen.
Sebagian sorbitol ditambahkan pada campuran HPMC yang sudah dikembangkan dengan gliserin dalam mortir selama 15 menit. Kemudian xylitol
paraben dan campuran minyak kayu manis dan pepermint dimasukkan dalam campuran. Setelah homogen, campuran ditambahkan kalsium karbonat sedikit demi sedikit. Bila campuran ini menjadi kering atau keras, tambahkan sodium lauril sulfat yang sudah dilarutkan gliserin sedikit demi sediki. Pada tahap akhir pembuatan, campuran ditambahkan sisa sorbitol dan diaduk selama 3 menit sampai homogen.
10.Pengujian sifat fisik pasta gigi minyak kayu manis
a. Uji organoleptis. Pengamatan organoleptis terhadap pasta gigi minyak kayu manis, meliputi bentuk, warna, dan bau.
b. Uji pH. Pengukuran pH pasta gigi dilakukan dengan menggunakan kertas indikator pH. Pengukuran pH dilakukan 48 jam setelah pembuatan, 7 hari, 14 hari, 21 hari, dan 28 hari penyimpanan.
c. Uji viskositas. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan alat Viscometer Rion seri VT 04. Pasta gigi dimasukan ke dalam wadah hingga penuh dan di pasang pada portable viscotester. Viskositas pasta gigi diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Uji ini dilakukan 48 jam setelah pembuatan untuk mengetahui efek faktor terhadap viskositas. Sedangkan untuk memonitor perubahan viskositas, dilakukan pengukuran viskositas pada 7 hari, 14 hari, 21 hari, dan 28 hari penyimpanan.
d. Uji daya lekat. Pengukuran daya lekat dilakukan dengan menggunakan alat uji daya lekat. Sebanyak 0,25 gram pasta gigi ditempatkan pada gelas
objek, kemudian ditutup bagian atasnya dengan gelas objek dan ditimpa menggunakan beban 1 kg selama 2 menit. Alat pengujian daya lekat dipreparasi sedemikin rupa, kemudian beban seberat 80 gram ditempatkan pada bagian ujung alat yang menggantung. Pengukuran dihentikan setelah kedua gelas objek terpisah.
11.Uji aktivitas antibakteri pasta gigi minyak kayu manis terhadap Streptococcusmutans dengan metode difusi sumuran.
Media TSA dibuat dengan mencampurkan sebanyak 32 gram serbuk TSA dan 800 mL akuades. Media TSB dibuat dengan mencampurkan sebanyak 1,5 gram serbuk TSB dan 50 mL akuades. Kedua media tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Pengujian aktivitas antibakteri pasta gigi minyak kayu manis terhadap bakteri Streptococcus mutans dilakukan dengan pembuatan sumuran pada media yang dibuat dengan menggunakan metode double layer, dimana sebanyak 10 mL media TSA dituang ke dalam petri sebagai base layer kemudian dibiarkan memadat terlebih dahulu. Sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri Streptococcus mutans yang sudah disetarakan dengan larutan standar McFarland 0,5 diinokulasikan ke dalam 30 mL media TSA pada suhu 45-50°C (sebagai seed layer), lalu dituang ke dalam petri berisi base layer yang sudah memadat. Setelah memadat, lalu dibuat sumuran sampai batas antara base layer dan seed layer secara aseptis.
Untuk pengujian aktivitas antibakteri, setiap formula pasta gigi direplikasi sebanyak 3 kali menggunakan 3 petri. Setiap petri yang berisi media TSA dibuat sumuran sebanyak 4 lubang menggunakan pelubang berdiameter 7 mm. Setiap sumuran diisi dengan pasta gigi (sampel) sesuai formula, kontrol negatif (basis pasta), kontrol positif (pasta gigi merk X), dan minyak kayu manis KBM menggunakan spuit injeksi 1 ml masing-masing sebanyak 0,020 ml. Pembuatan lubang sumuran sampai batas antara base layer dan seed layer supaya destilat tidak menyebar pada dasar cawan petri. Proses pengerjaan dilakukan di
Microbiological Safety Cabinet (MSC).
Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, lalu diukur zona hambat yang terbentuk menggunakan jangka sorong digital. Diameter zona hambat yang terbentuk dikurangi diameter sumuran yang digunakan yaitu 7 mm. Aktivitas antibakteri diamati berdasarkan diameter zona hambat yang dihasilkan dibandingkan antar formulanya.
12.Uji iritasi pasta gigi minyak kayu manis dengan metode Slug Mucosal Irritation (SMI) assay.
a. Penimbangan mukus. Slug (Arion lusitanicus) dipilih dan ditimbang dengan berat antara 2,5 – 3 gram. Petri kosong ditimbang dan ditambah dengan 500 mg sampel, kemudian petri dan sampel tersebut ditimbang kembali. Slug
diletakkan di atas sampel dan didiamkan selama 30 menit. Slug kemudian dibersihkan dari mukus. Mukus yang terdapat pada petri ditimbang. Mukus yang diproduksi (MP) dihitung dengan rumus :
𝑀𝑃 =𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡𝑚𝑢𝑘𝑢𝑠 (𝑔𝑟𝑎𝑚)
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡𝑠𝑖𝑝𝑢𝑡 (𝑔𝑟𝑎𝑚) × 100%
MP tersebut diklasifikasikan menjadi 4 kategori yaitu tidak mengiritasi (non irritating) bila produksi mukus <15%, mengiritasi ringan (mild), bila produksi mukus 15-20%, mengiritasi sedang (moderate), bila produksi mukus 20-25%, dan mengiritasi berat (severe), bila produksi mukus >25%
