BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN 3.1Jenis dan Rancangan Penelitian
3.6 Tata Cara Penelitian
3.5 Skema Kerja Penelitian
3.6 Tata Cara Penelitian
3.6.1 Sterilisasi Ruang, Alat, dan Bahan
Kabinet LAF dibersihkan dengan menggunakan etanol 70% kemudian lampu UV dinyalakan selama 24 jam. Proses ini dilakukan sebelum proses pembuatan hydrocolloid matrix
piroksikam. Kemudian dilanjutkan proses sterilisasi bahan seperti piroksikam, HPMC, propilen glikol, dan gliserol dengan cara sterilisasi panas kering menggunakan oven pada suhu 180oC selama 1 jam, sedangkan akuades disterilisasi dengan cara dididihkan hingga suhu 100oC. Alat-alat gelas disterilisasi dengan panas kering, yaitu menggunakan oven pada suhu 180oC selama 1 jam.
3.6.2 Pembuatan Sediaan Hydrocolloid matrix Ibuprofen
Sediaan yang akan dibuat adalah sediaan hydrocolloid matrix ibuprofen diabetic wound healing dengan variasi konsentrasi HPMC. Pemilihan formula dalam penelitian ini mengacu pada formula hydrocolloid film oleh (Thu et al., 2012). Formula tersebut adalah sebagai berikut:
Sterilisasi Ruangan, Alat dan Bahan Pembuatan hydrocolloid matrix ibuprofen Uji sterilitas hydrocolloid matrix ibuprofen
Uji sifat fisika kimia dan stabilitas hydrocolloid matrix ibuprofen Uji aktivitas formula optimum hydrocolloid matrix ibuprofen
Analisis hasil dan penulisan laporan
35
Tabel 1. Formula hydrocolloid film oleh (Thu et al., 2012)
Formula Hydrocolloid film
Ibuprofen 5 g Sodium alginate 6 g Propylene glycol 15 mL Etanol 5 mL Gliserol 6 mL Akuades 74 mL
Modifikasi formula yang digunakan pada penelitian kali ini adalah sebagai berikut:
Tabel 2. Modifikasi formula hydrocolloid matrix
Formula BF1 BF2 BF3 F1 F2 F3 Ibuprofen - - - 0,175 g 0,175 g 0,175 g HPMC 4,375 g 5,5 g 6,625 g 4,375 g 5,5 g 6,625 g Propylene glycol 7,8 g 7,8 g 7,8 g 7,8 g 7,8 g 7,8 g Etanol 14 mL 14 mL 14 mL 14 mL 14 mL 14 mL Gliserol 3,78 g 3,78 g 3,78 g 3,78 g 3,78 g 3,78 g Akuades ad 50 g ad 50 g ad 50 g ad 50 g ad 50 g ad 50 g
HPMC ditimbang sesuai dengan formula, kemudian dilarutkan dalam akuades dan diaduk dengan stirrer hingga terbentuk gel dalam suhu 40°C. 0,175 gram ibuprofen yang sudah ditimbang dilarutkan dalam 15 mL propylene glycol dan 14 mL etanol, kemudian ditambahkan ke dalam gel HPMC dan diaduk dengan stirrer hingga homogen. Selanjutnya ditambahkan 3,78 gram gliserol seiring dilakukannya pengadukan dengan stirrer. Campuran gel tersebut kemudian dituang ke dalam tabung reaksi bertutup sebanyak12,5 gram, kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 115oC selama 15 menit. Setelah itu, gel dituangkan ke cawan petri secara aseptis dalam kabinet LAF, kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 45°C dan selama
36
minimal 48 jam hingga mencapai ketebalan 0,5 mm. Sediaan kemudian dicetak dalam bentuk lingkaran dengan diameter 1 cm dan disimpan di suhu ruang (Thu et al., 2012).
3.6.3 Uji Sterilitas
Kabinet LAF dibersihkan dengan menggunakan etanol 70% lalu disinari dengan lampu UV selama 24 jam. Proses ini dilakukan selama 24 jam sebelum proses pembuatan patch hydrocolloid
ibuprofen. Peralatan yang akan digunakan juga disterilkan sebelumnya menggunakan autoklaf pada 121oC selama 15 menit.
Nutrient Agar (Oxoid) sebanyak 21 gram ditambahkan dengan 750 mL akuades, kemudian diaduk homogen dengan batang pengaduk. Media dipanaskan dengan hotplate magnetic stirrer sampai tercampur homogen. Media kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 15 mL, seluruh media dalam tabung reaksi lalu disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 1 kgf/cm2 dan suhu 121oC. Media yang telah steril kemudian dituang ke cawan petri dan dibiarkan memadat. Hydrocolloid matrix ibuprofen disiapkan, kemasannya dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%. Hydrocolloid matrix piroksikam diambil dari wadah penyimpanannya secara aseptis dekat nyala bunsen, kemudian ditempelkan pada permukaan media agar. Tiap petri diberi label dan dibungkus plastic wrap, lalu diinkubasi terbalik dalam LAF selama 24 jam.
3.6.3 Uji Organoleptis
Dilakukan dengan mengamati dan meneliti warna, kejernihan dan kehalusan dari sediaan hydrocolloid matrix yang telah dibuat (Shirsand, Ladhane, Prathap, & Prakash, 2012).
37 3.6.4 Uji Keseragaman Bobot
Sebanyak 10 sediaan hydrocolloid matrix dari masing-masing formula satu persatu ditimbang dan dihitung rata-rata bobot sediaan (British, 1993).
3.6.5 Uji Ketebalan
Ketebalan hydrocolloid matrix berdiameter 1 cm dihitung pada 5 titik berbeda (keempat sudut dan bagian tengah) dengan jangka sorong, kemudian dihitung rata-rata ketebalan sediaan (El-Gendy, Abdelbary, El-Komy, & Saafan, 2009).
3.6.6 Uji pH Larutan Sediaan
Setiap formula hydrocolloid matrix berdiameter 1 cm direndam dalam 20 mL akuades pada suhu 36,5OC- 37,5OC selama 24 jam, kemudian pH larutan tersebut diukur dengan pH meter (British, 1993).
3.6.7 Uji Persentase Moisture Content
Setiap hydrocolloid matrix berdiameter 1 cm dikondisikan dalam sebuah desikator berisi silika selama 24 jam. Setelah itu masing-masing hydrocolloid matrix ditimbang sampai didapatkan bobot yang tetap dan konstan (Toshkhani et al. 2013).
3.6.8 Uji Persentase Moisture Absorption
Setiap hydrocolloid matrix berdiameter 1 cm yang sudah diuji moisture content-nya diletakkan dalam climatic chamber
dengan RH 85% pada suhu 28oC. Sediaan kemudian diambil dan ditimbang kembali (Toshkhani et al. 2013).
3.6.9 Uji Ketahanan Pelipatan (F olding Endurance)
Hydrocolloid matrix berdiameter 1 cm dilipat secara berulang pada posisi yang sama hingga rusak. JumLah pengulangan pelipatan tanpa merusak sediaan merupakan nilai dari ketahanan pelipatan (Shirsand et al., 2012).
38
3.6.10 Pembuatan Kurva Baku Ibuprofen
Sebanyak 20 mg ibuprofen ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan dilarutkan dalam 15 mL metanol. Kemudian ditambah dengan PBS pH 6,4 untuk memperoleh konsentrasi 200 µg/mL. Dari larutan stok tersebut diambil 10 mL dan dipindahkan ke dalam labu takar 100 mL, lalu dilarutkan dengan pelarut yang sama untuk memperoleh konsentrasi 20 µg/mL. Dari larutan intermediet tersebut, diambil 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; dan 9,0 mL, dipindahkan ke dalam labu takar 10 mL dan dilarutkan dengan pelarut yang sama untuk memperoleh konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 µg/mL. Panjang gelombang maksimal ditentukan dari larutan intermediet (konsentrasi 20 µg/mL) yang dibaca menggunakan spektrofotometer UV pada rentang 200-400 nm. Kemudian seluruh larutan seri dianalisis pada panjang gelombang maksimal (Garg et al. 2014).
3.6.11 Uji Keseragaman Kandungan Obat dalam Matrix
Sebanyak 3 hydrocolloid matrix diameter 1 cm dari masing-masing formula dilarutkan dalam 15 mL metanol dan 35 mL PBS pH 6,4, kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang maksimal menggunakan spektorfotometer UV. Blanko yang digunakan sebagai pembanding adalah metanol (Shirsand et al., 2012).
3.6.12 Uji Pelepasan Obat secara In Vitro
Uji pelepasan ibuprofen dari sediaan dilakukan menggunakan sel difusi tipe vertikal pada suhu 36,5 ± 1oC. Sebanyak 15 mL PBS pH 6,4 dimasukan pada sel difusi sebagai kompartemen aseptor. Membrane Millipore 0,45 mm sebelumnya direndam dalam larutan aseptor yang sudah dibuat selama 1 jam, kemudian matriks dipasang pada sel difusi. Pada menit ke 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300, dan 360 kompartemen aseptor
39
disampling dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimal. Penentuan kadar dengan plot kurva baku ibuprofen. Perhitungan nilai dissolution efficiency
dengan persamaan %DE(t), yang merupakan dissolution efficiency
pada waktu 360 menit (Pudyastuti, Nugroho, & Martono, 2014). 3.6.13 Uji Iritasi Kulit
Punggung tiga ekor kelinci dicukur 24 jam sebelum pengujian. Dalam satu punggung diaplikasikan 1 kontrol positif etil asetat, 1 kontrol kassa steril dan 3 basis hydrocolloid matrix yang ditutup plester hypavix selama 4 jam. Pengamatan dilakukan pada jam ke-1, 24, 48 dan 72 jam terhadap eritema dan udema yang terjadi pada kulit yang terpapar sampel. (Shirsand et al. 2012). 3.6.14 Uji stabilitas
Semua hydrocolloid matrix diletakkan dalam paparan 2 suhu yang berbeda yaitu 37°C dan 45°C. Hydrocolloid matrix
diobservasi dalam suhu tersebut selama 4 minggu. Dilakukan analisis fisik dan analisis kandungan obat pada patch di setiap akhir minggu. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan diambil rata-rata dari setiap replikasi yang dilakukan (Amjad et al., 2011). 3.6.15 Uji Aktivitas Sediaan Hydrocolloid matrix Ibuprofen
Enam ekor tikus putih jantan umur 2-3 bulan dengan berat 150-180 gram dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok perlakuan terdiri dari 3 ekor tikus diabetes dengan kadar gula darah > 250 mg/dL dan kelompok kontrol terdiri dari 3 ekor tikus tidak diabetes. Tikus diabetes diperoleh dengan menginjeksi aloksan monohidrat 5% secara intraperitoneal dengan dosis 150 mg/kgBB. Setiap tikus dianestesi dengan injeksi ketamin 10% pada dosis 80 mg/kgBB secara intramuscular. Pada tiap tikus diberikan 5 luka eksisi menggunakan biopsy punch berdiameter 5 mm. Luka dibuat pada punggung tikus yang sudah dicukur 48 jam sebelumnya. Kelima luka eksisi pada 1 ekor tikus diberi perlakuan berbeda,
40
yaitu: kontrol tanpa perlakuan, basis hydrocolloid matrix (HPMC), basis hydrocolloid matrix (PVP), hydrocolloid matrix (HPMC) piroksikam, dan hydrocolloid matrix (PVP) piroksikam. Penggantian sediaan dilakukan setiap 24 jam sampai luka menutup. Setelah luka sembuh, tikus dieuthanasia dengan injeksi ketamin dengan dosis 100 mg/kgBB. Kulit punggung diambil dengan ukuran 2x2 cm dan disimpan dalam pot berisi formalin 10%.
Gambar 3. Pola Perlakuan Luka pada Punggung 2 Kelompok Tikus
Tabel 3. Keterangan Pola Luka pada Punggung 2 Kelompok Tikus
Keterangan Tikus 1 Tikus 2 Tikus 3
a Kontrol HM (PVP) Ibu HM (HPMC) Ibu
b Basis HM (HPMC) Kontrol HM (PVP) Ibu
c Basis HM (PVP) Basis HM (HPMC) Kontrol
d HM (HPMC) Ibu Basis HM (PVP) Basis HM (HPMC)
e HM (PVP)
Ibu HM (HPMC) Ibu Basis HM (PVP)
3.6.16 Uji histopatologi – pengecatan Hematoxylin-Eosin (HE)
Sampel berupa jaringan kulit dari perlakuan diambil, kemudian dilakukan pengecatan dengan hematoxylin-eosin, lalu dilihat dibawah mikroskop untuk melihat perubahan histopatologisnya.
a. Trimming. Pemotongan tipis jaringan dengan pisau skalpel.
c b a d
41
b. Dehidrasi. Dehidrasi dilakukan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan dengan menggunakan reagen pembersih, lalu dilakukan impregnasi (penetrasi parafin ke dalam jaringan).
c. Embedding dan cutting. Jaringan yang sudah di dehidrasi diletakkan di atas sebuah balok kayu (embedding) sebagai alas pemotongan jaringan dengan pisau mikrotom (cutting).
d. Staining. Rangkaian pewarnaannya adalah sebagai berikut: Xylol I (5 menit); Xylol II (5 menit); Xylol III (5 menit); alkohol absolut I (5 menit); alkohol absolut II (5 menit); akuades (1 menit);Harris Hematoxylin (20 menit); akuades (1 menit);acid alkohol (2-3 celupan); akuades (1 menit); akuades (15 menit); Eosin (2 menit); alkohol 96% I (3 menit); alkohol 96% II (3 menit); alkohol absolut III (3 menit); alkohol absolut IV (3 menit); Xylol IV (5 menit); Xylol V (5 menit).
e. Mounting. Menutup kaca objek dengan kaca penutup
f. Pembacaan slide dengan mikroskop. Pengamatan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya (Olympus tipe BH-2, Olympus Corp., Jepang).