BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
Sampel yang dipilih dan digunakan dalam penelitian ini adalah sediaan
racikan pulveres dengan zat aktif hidroklorotiazid dan captopril yang diracik di
apotek X dengan resep sebagai berikut :
R/ Captopril 12,5 mg
Hidroklorotiazid 25 mg
Mfla. Pulv. d.td. no IX
Berdasarkan resep diketahui kadar teoritis hidroklorotiazid adalah 25 mg
dan captopril adalah 12,5 mg. Selanjutnya ketika dilakukan penimbangan tablet
captopril dan hidroklorotiazid yang digunakan apotek X untuk membuat
sediaan racikan pulveres didapatkan bobot teoritis adalah 276,6 mg dengan
Pengambilan sampel dilakukan sebanyak tiga kali dalam waktu yang
berbeda-beda, dan setiap pengambilan didapatkan 9 bungkus pulveres. Seluruh
sampel pulveres yang diperoleh diuji terlebih dahulu keragaman bobotnya,
kemudian dari total sembilan bungkus pulveres diambil tiga bungkus untuk uji
keseragaman kandungan dan enam bungkus untuk dilakukan pengujian kadar
air. Total sampel pulveres yang digunakan dalam penelitian ini adalah 27
bungkus.
2. Uji keragaman bobot pulveres
Sembilan bungkus pulveres ditimbang satu persatu menggunakan neraca
analitik. Proses penimbangan adalah ditimbang terlebih dahulu isi pulveres
dengan bungkusnya, kemudian isi pulveres dikeluarkan dan bungkus pulveres
ditimbang kembali. Bobot isi tiap bungkus pulveres didapatkan dari hasil
selisih antara nilai bobot pulveres dan bungkusnya dengan nilai bobot bungkus
pulveres dengan sisanya.
Uji kadar air Uji keragaman bobot Uji keseragaman kandungan 3x 3x 6 Bungkus 3 Bungkus 9 Bungkus Ran d o m 3x
3. Uji keseragaman kandungan
a. Verifikasi metode KCKT.
1) Pembuatan fase gerak dan pelarut. Fase gerak dan pelarut yang
digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dan air dengan
perbandingan 95:5 v/v. Metanol grade KCKT dan air (aquabidestilata) masing-masing disaring menggunakan organic solvent membrane filter
untuk metanol, dan anorganic solvent membrane filter untuk aquabidestilata dengan bantuan pompa vaccum. Kemudian diletakkan pada wadah fase gerak KCKT, di mana metanol di wadah fase gerak B
sedangkan aquabidestilata di wadah fase gerak A, lalu fase gerak tadi
di-degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit sebelum digunakan. Fase gerak dan pelarut pada penelitian ini menggunakan
komposisi dan senyawa yang sama, dengan tujuan untuk meminimalisir
gangguan pelarut pada detektor KCKT seperti jika komposisi fase gerak
dan pelarut berbeda.
2) Pembuatan larutan baku hidroklorotiazid.
a) Pembuatan larutan stok baku hidroklorotiazid. Hidroklorotiazid
ditimbang lebih kurang 100 mg secara seksama, dan dimasukkan ke
dalam labu ukur 50 mL kemudian dilarutkan dengan pelarut berupa
campuran metanol dan air (95:5) sampai batas tanda hingga diperoleh
larutan stok hidroklorotiazid dengan konsentrasi 2 mg/mL.
b) Pembuatan larutan intermediet baku hidroklorotiazid. Sebanyak 5 mL
dalam labu ukur 10 mL. Kemudian diencerkan dengan pelarut sampai
batas tanda hingga diperoleh larutan intermediet hidroklorotiazid
dengan konsentrasi 1 mg/mL.
c) Pembuatan seri kurva baku hidroklorotiazid. Larutan intermediet
hidroklorotiazid diambil sebanyak 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 dan
160 µl. Masing-masing larutan tersebut kemudian diencerkan dengan
pelarut dalam labu takar 10 mL hingga batas tanda dan didapatkan 8
seri baku yaitu 0,002; 0,004; 0,006; 0,008; 0,01; 0,012; 0,014 dan
0,016 mg/mL. Seri baku hidroklorotiazid disaring dengan milipore
dan di-degassing selama 5 menit.
3) Penentuan panjang gelombang pengamatan hidroklorotiazid. Tiga seri
konsentrasi baku 0,012; 0,014; dan 0,016 mg/mL diambil kemudian
larutan di-scanning pada panjang gelombang 200-400 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang
pengamatan ditentukan berdasarkan spektra serapan maksimum yang
dihasilkan sehingga diperoleh panjang gelombang maksimum yang akan
diaplikasikan pada pengukuran dengan KCKT.
4) Pembuatan persamaan kurva baku. Larutan 8 seri baku hidroklorotiazid
yaitu 0,002; 0,004; 0,006; 0,008; 0,01; 0,012; 0,014 dan 0,016 mg/mL
disaring dengan milipore dan di-degassing 5 menit, kemudian disuntikkan ke dalam sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam
oktadesil silika (C18) dan fase gerak metanol : air (95:5), dengan
masing-masing konsentrasi seri baku dibuat kurva regresi linier yang
menyatakan hubungan antara konsentrasi seri baku hidroklorotiazid
dengan AUC untuk memperoleh regresi linier dengan persamaan y = bx
+ a dan nilai koefisien korelasinya (r).
5) Preparasi sampel.
a) Pembuatan larutan stok sampel. Satu bungkus pulveres digerus dan
dihomogenkan menggunakan mortir dan steamper. Sampel yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang 50 mg, kemudian
dilarutkan dengan pelarut. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 25
mL, dan ditambahkan pelarut sampai tanda, sehingga diperoleh
larutan stok sampel.
b) Pembuatan larutan intermediet sampel. Sebanyak 5 mL larutan stok
sampel diambil, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan
diencerkan dengan pelarut hingga tanda.
c) Pembuatan larutan sampel. Sebanyak 500 µL larutan intermediet
sampel diambil, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan
diencerkan dengan pelarut hingga tanda. Larutan tersebut disaring
dengan milipore dan dimasukkan ke dalam vial KCKT, kemudian
di-degassing selama 5 menit. b. Validasi metode analisis.
1) Penentuan resolusi sampel. Larutan sampel dibuat dari 3 bungkus
dengan konsentrasi 10 µL, kemudian disaring, di-degassing, dan diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi.
2) Penentuan akurasi dan presisi. Penentuan akurasi dan presisi berdasar
pada persen perolehan kembali (recovery) dan nilai koefisien variasi (KV). Sebanyak 500 µL larutan intermediet sampel diambil sebanyak 4
kali. Masing-masing larutan dimasukkan kedalam labu ukur 10,0 mL dan
diberi label a, b, c, dan d. Larutan a diencerkan dengan pelarut hingga
tanda sehingga diperoleh larutan sampel tanpa adisi. Larutan b, c, dan d
ditambahkan baku hidroklorotiazid masing-masing sebanyak 40µL,
60µL, dan 80 µL. Kemudian masing-masing diencerkan dengan pelarut
hingga tanda, sehingga diperoleh larutan sampel adisi 4 µg/mL, 6 µg/mL,
8 µg/mL. Replikasi dilakukan 3 kali. Kedua macam sampel ini digunakan
untuk memperoleh nilai persen perolehan kembali dan nilai koefisien
variasi.
3) Pembuatan kurva baku dan penentuan linieritas. Sebanyak 8 seri larutan
baku hidroklorotiazid yaitu 0,002 mg/mL; 0,004 mg/mL; 0,006 mg/mL;
0,008 mg/mL; 0,01 mg/mL; 0,012 mg/mL; 0,014 dan 0,016 mg/mL
disaring dengan milipore dan di-degassing 5 menit, kemudian disuntikkan ke dalam sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam
oktadesil silika (C18) dan fase gerak metanol : air (95:5), dengan
kecepatan alir 1,0 mL/menit. Hasil yang didapat berupa AUC pada
masing-masing konsentrasi seri baku dibuat kurva regresi linier yang
dengan AUC untuk memperoleh regresi linier dengan persamaan y = bx
+ a dan nilai koefisien korelasinya (r) yang akan digunakan untuk
menentukan parameter validasi linearitas.
c. Penetapan kadar hidroklorotiazid dalam pulveres. Sebanyak tiga bungkus
pulveres dalam setiap pengambilan sampel ditimbang secara seksama,
masing-masing bungkus direplikasi tiga kali. Setiap replikasi ditimbang
secara seksama sampel sejumlah 50 mg, dimasukkan ke dalam labu ukur
25,0 mL, kemudian dilarutkan dengan pelarut sampai tanda hingga
didapatkan larutan stok sampel. Larutan stok sampel yang sudah dibuat
kemudian disaring menggunakan kertas saring selanjutnya dilakukan
penyaringan menggunakan milipore untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang dapat mengganggu proses elusi di KCKT. Sebanyak 5 mL larutan
stok sampel diambil dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL untuk
selanjutnya diencerkan dengan pelarut sampai tanda sehingga diperoleh
larutan intermediet sampel. Selanjutnya diambil 500 µL larutan intermediet
dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL, diencerkan dengan pelarut
hingga batas tanda dan di-degassing selama 15 menit. Sebanyak 10 µL larutan sampel diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan kolom oktadesil
silika (C18) (250 x 4,6 mm), menggunakan perbandingan fase gerak metanol
: air (95:5) dan kecepatan alir 1,0 mL/menit.
4. Uji kadar air
Uji kadar air dalam pulveres dilakukan untuk melihat salah satu
bungkus pulveres untuk setiap waktu pengambilan dengan menggunakan moisture analyzer dan parameter yang diukur adalah % moisture content.
Tiga serbuk pulveres yang baru diambil dari apotek digerus dalam mortir
dan stamper kemudian dimasukkan ke dalam moisture analyzer sebanyak lebih
kurang 100 mg. Suhu alat diatur pada 120˚C dan waktu pengeringan diatur selama
90 detik. Nilai % moisturecontent yang ditampilkan pada alat setelah pengukuran dicatat sebagai kadar air sebelum penyimpanan. Penyimpanan dilakukan selama 9
hari pada suhu ruangan, kemudian dilakukan pengujian yang sama terhadap tiga
bungkus sisa dan dicatat sebagai kadar air setelah penyimpanan.
G. Analisis Hasil